目前,我国需要器官移植的患者与器官供需的比例仅为150:1。而猪的心脏、肝脏、肾脏、胰岛、神经细胞以及软骨细胞，与人的相应器官、组织和细胞在结构、功能上几乎完全一致，移植在患者身上完全可以发挥原有器官的作用，但一些免疫学问题以及与异种移植相关的困难尚未被克服。实际上，将转基因猪器官移植到非人灵长类动物上所出现的超急级性或急性反应已经得到解决，但还有其他问题凸显出来，如：移植物中血栓性血管病变以及受体系统性消耗性凝血问题。为了解决这些问题，表达一种或几种人类血栓调节基因以及抗炎基因的猪已经被繁殖出来。
简介
猪的心脏瓣膜移植，和组织用于整形外科的组织移植（如韧带重建）及一般移植手术（如小肠粘膜下层以及膀胱修复）已有几十年的历史。然而，这些移植物主要是一些结构组织，移植后的组织逐渐被人类细胞重新取代填充。尽管这些步骤移植手术代表了异种器官移植的形式（即跨物种移植），但本文研究的主要目的是提供可用的猪器官和细胞移植，使得它们在临床移植后能够继续发挥功能。
几十年来，人们一直在寻求用于临床移植的器官和细胞的新来源；来源于死者捐献的组织如胰岛和神经细胞从未曾满足过需求。异种器官移植（例如，将猪的器官移植到人身上）或许可以解决这个问题。胰岛移植可以用来治疗糖尿病，神经细胞移植可以用来治疗神经退行性疾病如帕金森氏病，肝细胞移植可以用来治疗肝功能衰竭，眼角膜细胞移植可以用来治疗各种失明患者，甚至可以用猪红细胞进行输血。随着储存技术的成功应用，猪的角膜、胰岛以及一些细胞（包括红细胞）能够从发达国家（有转基因动物）运输到发展中国家（对生物产品的需求量很大）。
本文重点介绍将猪的器官移植到非人类灵长类动物的临床前研究。相关研究在过去的十年中已经取得了很大的进步。但是，由于转基因技术的日趋成熟，研究人员可以根据不同的临床需求“定制”生产特定的转基因猪，后者最大的优势是可以避免宿主针对移植物所产生的免疫排异反应。一般来说，这种基因修饰经过几代之后就会稳定遗传。虽然关于猪胰岛、角膜以及神经细胞的异种移植指日可待，然而在猪器官移植作为临床治疗之前，还需要克服很多困难。目前，在新西兰正在进行一项政府主导的关于猪胰岛移植治疗的临床研究。
#p#副标题#e#
猪器官移植
将一个野生型猪器官移植给一名患者或者非人灵长类动物时，其所面临的首要问题是超急性排异反应。这主要是由于受体自身抗体与猪器官的抗原进行结合后所产生的免疫反应，这种免疫反应能够破坏移植物微循环血管，最终导致移植失败。上述免疫病理损伤产生的机制与同种异体移植物穿过血脑屏障时发生的反应极为相似。
在猪的组织器官异种移植过程中，人类抗体所介导的免疫反应针对的主要靶抗原是一种叫做半乳糖α-1 ,3-半乳糖的低聚糖，后者在人、猿和猴中不存在。通过同源重组与体细胞核移植技术能够将猪中编码半乳糖α-1,3-半乳糖的基因敲除掉。2003年首次将这一α-1,3-半乳糖转移酶基因敲除猪（GTKO）应用于试验研究。相关研究结果显示，将GTKO猪的器官移植到非人灵长类动物能够降低超急性排异反应。当对表达一个或多个人类补体调节蛋白（hCRPs），如：CD46、CD55或CD59的猪器官进行移植时，发生超急性排异反应的概率也大大降低。
强效免疫抑制剂的应用也是异种移植有望最终在临床应用的基础。应用合适的免疫抑制剂能够延长移植器官的存活时间，超急性反应或者延迟性抗体介导的排异反应以及体液急性反应都大大降低。在此基础上，急性排异反应已不是移植失败的主要原因，移植失败很可能是供体器官的功能缺失所致。在异种移植过程中，微血管血栓形成是导致移植器官功能缺失的主要原因。而猪和灵长类动物凝血-抗凝血系统的不同可能是移植器官微血管血栓形成的原因。这可能起始于猪血管内皮组织的免疫激活，后者会增加猪组织因子的表达和活性，导致凝血与抗凝血发生改变。然而，研究者在体外发现，在没有抗体存在的情况下，猪血管内皮细胞足以激活灵长类血小板和外周血单核细胞。灵长类组织因子表达以及循环系统中血小板和外周血单核细胞的增加表明了有系统性反应存在，使得反应更加复杂。
然而，问题并不仅仅局限于凝血系统。初步的数据表明，猪的器官在灵长类动物体内能够激发系统性炎症反应，这涉及了原始免疫细胞、血小板、淋巴细胞的激活以及全身的级联反应。例如：组织因子是一个促炎症反应的介导者。而免疫反应、凝血以及炎症的内在关系，还需要进一步研究。
虽然在有足够免疫抑制剂存在的情况下，很少出现超急性排异反应、急性细胞排异反应以及急性体液反应，但在存活几个月的移植心脏中依然有血管病变的慢性排异反应。随着异种移植免疫学障碍的克服，发生移植物血管病变的情况将会被大大延迟。
与心脏和肾移植相比，将猪肝脏或者肺移植到非人类灵长类的存活率大大降低。原位移植的肝脏，即使是来自于GTKO猪，存活也不到1周。循环系统中的血小板会很快消失，从而导致身体多部位内出血。猪肝脏的存在导致血小板迅速聚集或吞噬。然而，在短时期内，猪肝脏通过产生蛋白，可能发挥令人满意的作用。如果能够阻断血小板减少，则猪的肝脏可能在那些暴发性肝衰竭患者中发挥作用。
猪的肺是被迅速凝血功能紊乱破坏最严重的器官，在非人类灵长类体内发挥功能很少超过24小时，即使通过去除供体vWF以及肺部巨噬细胞也不会有很大改善。到目前为止，关于肺移植的结果还是令人失望的。
猪心脏可能成为异种移植的桥梁，或许可以进行胸廓内异位移植，从而作为一些病人左心室辅助装置的替代品。鉴于消耗性凝血对生命有威胁以及慢性肾衰竭患者透析的应用，肾异种移植的前景还不太乐观。并且，将猪肾移植到非人灵长类后，受体不可避免地会出现蛋白尿，需要连续输入人血白蛋白；而这一治疗在临床上是无法实施的。关于蛋白尿形成的原因，到底是由于免疫反应还是猪和灵长类生理性的不匹配，或者二者兼而有之目前还不清楚。总之，在未来几年内，临床上应该不会进行猪器官的异种移植。
#p#副标题#e#
猪胰岛移植
将猪胰岛移植到非人类灵长类糖尿病动物上所得到的结果比猪的其他器官移植更加令人兴奋。在未来几年内，猪胰岛异种移植的临床试验将继续扩大。然而，将猪胰岛与门静脉连接可能与早期移植失败相关，这主要是由于发生了所谓的快速血液介导的炎症反应。虽然我们对猪胰岛早期移植失败的机制还知之甚少，但有数据表明，抗体、补体以及凝血反应都参与了这一过程。很多生理过程都会被激发，至少在一定程度上，胰岛与受体血液直接的接触可能会激发一些反应。为了阻止这一有害作用，关于胰岛移植替代位点的研究也正在进行中。
虽然胰岛移植瞬间失败的几率很大（据估计为60%〜80%），但是在链脲菌素以及胰腺切除诱导的非人类灵长类糖尿病动物中，移植后有足够的细胞可以维持正常的血糖多达几个月。虽然新生猪表达半乳糖-a-1，3-半乳糖，但是这种表达会随着年龄的增长而消失。并且，成年猪已经基本不会表达这种抗原。虽然一些免疫抑制剂还没有应用于临床，但是将野生型成年或新出生猪的胰岛移植到非人类灵长类动物体内后，获得了令人兴奋的结果。将表达hCD46（人类补体调节蛋白）的转基因猪胰岛移植到非人灵长类动物体内，同时应用免疫抑制剂（并没有在临床上应用），可以使糖尿病猴子的正常血糖水平的时间最长保持到一年以上。这一结果也说明，抑制补体激活能够增加移植器官的存活时间。相比于成年猪，来源于新出生猪的胰岛样细胞簇具有更大优势，这主要是因为它们比较容易分离，并且在移植后能够增殖。再者，如果进行大规模的移植，等猪全部长到成年才开始移植，无论在饲养上还是资金上都比较困难。因此应用刚出生的猪能够降低费用。
其他研究者已经开始对胰岛的包装进行研究，此研究的主要目的是阻止抗体或者T细胞与胰岛接触，但却可以让胰岛素能够进入循环系统。这些研究既包含了非人类灵长类，也包括了人类，这些研究并没有使用免疫抑制剂。尽管得到了一些预期结果，如包装的胰岛细胞能够发挥功能达6个月，但是这些细胞能否存活更久还不清楚。虽然这种包装对进行第二次移植非常方便，但是胰岛可能会出现血管化不足等问题，并且移植腔室中可能出现气孔阻塞的问题。
猪神经细胞移植
据估计，在美国有八百万的神经性退化疾病患者，其中帕金森氏病最为常见。这种疾病主要与大脑内分泌多巴胺的细胞缺乏有关。一个可能的治疗方法就是用健康猪的神经细胞来替换这些无功能缺失的细胞。一个欧洲研究团队已经对猪胚胎神经细胞前体在非人灵长类帕金森动物中的潜能进行了研究。结果提示，即使将猪细胞植入一侧大脑半球，其动力功能也会得到极大改善，这与持续性的细胞活力有关，正电子扫描以及免疫组化都证明了这一点。
为了降低排异反应，一些研究者将表达CTLA4-Ig的人胚胎神经细胞前体植入人工诱导的帕金森氏猴子，并联合运用免疫抑制剂。移植后，一些动物出现了淋巴组织增生性疾病，这表明，免疫抑制效果太过于强烈。如果这个问题能够被解决，这种临床疗法可能被用于那些对早期疗法不敏感的患者。
猪肝细胞移植
肝异种移植主要是由于肝脏以及肝细胞的短缺，尤其在急性肝衰竭患者中。肝脏异种移植的潜在好处是：避免急性体液排异反应，快速恢复肝功能，对人类特定病毒耐受。Nagata及其同事发现将猪肝脏移植到非人类灵长类动物中存活的最长时间为200多天，并且能够发挥正常肝功能。
#p#副标题#e#
猪角膜移植
虽然在发达国家，来源于死亡个体捐献的角膜能够满足临床需要，但在其他地方，这种捐献远远不能满足需求。再者，随着世界范围内角膜外科手术的进行，很多角膜不能用于移植。目前关于将猪角膜移植到非人灵长类动物的临床前研究还不多。将野生型猪的角膜移植给猴子，同时眼局部给眼局部类固醇，移植物可以存活多达几个月。部分角膜移植比完整角膜移植存活的时间更长。
体外研究表明，GTKO/hCRP猪角膜比野生猪角膜发生体液免疫反应要低很多。在不久的将来，我们将很快从CIITA-低表达（MHCII 激活因子低表达）猪中获得角膜，我们期望至少在一定程度上避免CD4阳性T细胞直接引起的免疫反应。
猪红细胞移植
用猪红细胞进行输血将会解决世界范围内人红细胞的短缺，尤其是HIV感染率高的国家。从GTKO猪中获得的红细胞比那些ABO-不相容人体的红细胞具有更好的相容性。要取得更大的进步还要依赖于新的技术，如血红蛋白激动子，用来保证在红细胞中表达这些基因。
解决凝血问题的策略
在猪器官移植后，研究者正在做很多尝试以克服器官的凝血问题功能，在GTKO/hCRP猪中引入凝血调节蛋白或组织因子通路抑制因子等人抗凝血基因或抗血栓基因，如：凝血调节蛋白或组织因子通路抑制因子。此外，额外的转基因也需要用来降低炎症反应。抗炎以及抗凝血基因ENTPD1（CD39）被认为是一个潜在的候选基因。获得额外的一个或多个基因的GTKO/hCRP转基因猪已经成为现实，将这些猪器官移植到非人类灵长类的初步结果有望于几年内获得。
猪的器官移植过程中强效免疫抑制剂的应用也得到了令人振奋的结果：凝血功能似乎被延迟了，这表明细胞免疫系统在凝血中发挥了作用。在体内，T细胞对猪器官进行的免疫反应能够被免疫抑制剂所抑制，尤其是那些协同抑制剂，如抗CD154多克隆抗体。体外研究表明，虽然这些抑制剂能够抑制T细胞对猪淋巴抗原所引发的免疫反应，但是凝血酶能够加剧那些非依赖于这些抗原的T细胞免疫反应。虽然这一过程发生的确切机制还不太清楚，但是我们可以解释抗凝血疗法对降低移植免疫反应的好处。
对猪的基因进行修饰可以直接降低血液介导的免疫反应，这种免疫反应与胰岛移植早期失败有关。结果，研究者发现了只在胰岛表达的三种保护基因，这些基因包括TFPI、ENTPD1和CTLA4-Ig。额外基因的表达被证明是有效的，并且已经发现了一些候选基因。一些抗原的表达如N-羟乙酰神经氨酸能够激活机体的免疫系统。因此，来源于N-羟乙酰神经氨酸基因敲除猪的胰岛会更有优势。
猪胰岛与来源于人或转基因猪间充质干细胞的共移植能够降低血液介导的炎症反应，这可能是通过增强胰岛的再血管化和再生，以及阻止T细胞反应来实现的。
T细胞反应
虽然用免疫抑制剂可以控制T细胞介导的细胞免疫反应，但是降低免疫抑制剂的使用可能对机体更有利。GTKO/hCRP猪的产生就是用来克服初始的体液免疫反应。但是研究者发现，猪细胞中半乳糖α-1,3-半乳糖基因的缺失以及hCRP的存在，能够降低人T细胞增殖反应和细胞因子反应。然而这种降低或许还不足以应用到临床，因此，还有必要对猪进行进一步的基因修饰。
例如：已经可以获得表达CTLA4-Ig的转基因猪，并且这些动物血液中游离的CTLA4-Ig浓度超过了达到免疫抑制效果的浓度。由于这些转基因猪表达此基因的效率如此之高，以致于它们的免疫系统处于无功能状态，从而易受感染。然而将这些基因表达在所需的特定组织或许会更加有效。将表达人CTLA4-Ig的神经细胞用于患帕金森氏症的猴子上，也已经取得了一些成功。
降低免疫原性的一个替代方法是将猪CIITA基因进行突变，这样可以抑制内皮组织中猪淋巴抗原II的表达。目前虽然已经得到了CIITA基因突变猪，但这都建立在野生型基础上。这些猪看起来是健康的并且能够正常繁殖。在体外，当内皮细胞的CIITA发生突变，猪淋巴抗原II的表达将会降低，主要的T细胞免疫反应也因此会降低。目前正在将CIITA突变猪与GTKO/hCRP猪进行杂交，这样的后代应当能够对抗体介导和T细胞介导的免疫反应都有一定的抵抗力。
无论是异体移植还是异种移植，其目的都是期望达到移植耐受。为达到这一目的的工作还在进行当中。
#p#副标题#e#
生理学
即使能够克服移植中的免疫反应、凝血反应以及促炎症反应，能否确保移植物长久的存活（即猪的器官以及细胞是否能够在异体环境中长期发挥生理功能）目前还是个未知数。目前关于移植器官长时间存活的证据还不充分。尽管如此，猪心脏移植到非人灵长类能够发挥足够的功能长达两个月，这说明，猪心脏也许能够用于移植到体积匹配的患者身上。严重蛋白尿以及磷酸盐代谢的不同限制了猪肾移植。
虽然目前移植成功的肝脏还没有超过一周， 但如果能够阻止猪肝脏异种移植相关的血小板减少症，肝脏移植的前景还是比较乐观的。如果猪肝脏不能够产生患者生存必须的蛋白，可以通过转基因技术来确保能够产生人类所需蛋白。关于猪肺异体移植目前还很少，因此并不能够得出一些确定的结论，但是发挥气体交换的功能还是令人满意的。
因为猪胰岛素用于糖尿病患者已有10余年，并且猪胰岛素能够使糖尿病猴子存活时间长达一年多，因此临床上猪胰岛异种移植几乎可以确信能够成功。但是I型糖尿病的自身免疫反应是否危及猪胰岛的长期存活目前还不清楚。即使猪的胰岛功能逐渐减退，而正常间隔时间内再次移植也是可能的。如果胃粘膜下层有合适的位点供异种移植物附着或者有其他合适的位点存在，那么再次移植将会变得十分容易。欧盟报告指出，猪神经细胞能够产生足够的多巴胺来极大改善患帕金森氏疾病猴子的动力功能，这表明，这种方法在人类患者身上也是可以成功的。
安全性
人类病毒或微生物，如巨细胞病毒和EB病毒经常会随着移植物转移；来自于供体的其他微生物如：西尼罗河热、狂犬病、弓形虫以及艾滋病毒也会感染受体。但这些微生物将不会感染移植猪器官与细胞，因为它们已经在来源器官中被清除。定期检测动物能够避免这些器官和细胞被感染。
避免猪器官或细胞内源性逆转录病毒的转移是不可能的，因为它们的编码序列目前存在于所有猪细胞的细胞核中。然而，数据表明，这些病毒并不会对病人造成很大威胁。已有研究表明，运用siRNA技术可以用来防止异种器官移植后的猪内源性逆转录病毒激活，从而减少并发症的风险。锌指核酸酶技术可以从猪基因组删除猪内源性逆转录病毒，但这一方法还需进一步改进。
监督管理、法律和伦理问题
关于临床异种移植，在监管、法律和道德方面尚存在较大的争议。但是，异种移植的潜在利益很大，风险相对较小。因此，在审慎监管的条件下，似乎没有很好的理由来阻止临床实施。此外，临床异种移植可能会避免器官贩卖。
美国食品药品监督管理局以及其他国家的监管部门建议，凡是用于临床试验的猪都需要在无感染、条件严格可控的环境中繁殖和成长。然而，当只有胰岛拟用于临床移植时，即使猪不在如此严格的可控环境中，但只要保证其胰岛没有被微生物感染，监管当局可能也会允许其使用。这项政策将大大降低异种胰岛移植的临床和物流成本。
结论
虽然还有一些问题会延缓临床试验的进程，但猪胰岛、神经细胞以及角膜移植的实验结果还是令人兴奋的。随着新转基因猪的获得，有可能进一步提高细胞和角膜移植的效果。相信在未来2年〜3年内上述相关研究将正式进入临床试验。目前还没有关于影响临床试验安全顾虑的报道。
解决人体器官、组织和细胞短缺的替代方法包括机械或生物力学设备，其中一些已经处于后期阶段（例如，用于支持心脏左心室辅助装置），另外一些还处在早期阶段（如人工生物的肝支持装置）。干细胞可以提供细胞和组织，如胰岛β细胞或角膜内皮细胞，但是在不久的将来，将不大可能提供整个器官。然而对猪的组织和细胞进行临床异种移植的想法将很快成为现实。
（作者：贺利军、刘荣军）
参考文献：《Lancet》2012; 379: 672-683