为了能居住于最具收益的微环境中，进化压力会要求生命体即使在高危环境中也能生存。对于那些寄居于富含营养成分的人类肠道内的细菌而言，无论它们是人类的“朋友”或“敌人”，它们都需要巧妙的策略来存活于严峻、低pH的环境中，从而成功经过胃部进入肠道。当寄居于肠道的埃希氏杆菌（Escherichia coli）株在经过胃部遭遇低pH环境时，它们表现出一系列复杂的反应。其中的一些反应，包括氨基酸脱羧酶能够保证细胞质pH值维持在危险线之上。然而，由于细胞外膜的渗透性，这使得周质环境处于无保护状态，不得不面临外界危机四伏的低pH值环境。为此，这些细菌必须进化出一套巧妙的策略，从而保护周质内的蛋白质，避免发生不可逆的pH变性。各类伴侣蛋白（chaperone）形成网络体系，参与了该保护机制。其中关键的一种pH-应答成员为一类小但数量庞大的HdeA和HdeB蛋白，这类蛋白在低pH值的情况下被激活。最近发表于PNAS上的一项研究中，Foit等研究人员利用多种手段来探索E. coli的HdeA是如何通过低pH对少量酸性残基的质子化作用，从而从非活化、稳定折叠的二聚物转变为部分折叠的单倍体，最终获得一种可逆的绑定非折叠基底的能力的。
HdeA功能机制的神秘之处在于pH值究竟是如何通过启动其伴侣蛋白来改变HdeA特性的。由于该蛋白需要从胃部（pH 2）转移至肠道（pH 7），在这pH值巨变的过程中，最有可能还保有活性的残基为天冬氨酸盐（Asp）或谷氨酸盐（Glu）。Foit等在HdeA蛋白质家族中发现了几种基于保护Asp和Glu的潜在“pH转变”机制，以及这些存留的Asp和Glu在非活化的二聚体HdeA上的位置，还有一种强大的计算机方法，称为常数pH分子动力学（constant pH molecular dynamics (CpHmd)计算。这种CpHmd计算功能强大，能够计算每个Asp和Glu残基在经历了HdeA活化过程后的pKa值变化。研究人员发现，两种预计将经历最剧烈的pKa变化（D20和D51）转化为丙氨酸的变异天冬氨酸盐能产生多种HdeA，而这些HdeA在中性pH值环境中能持续保持活性。从热力耦合关系来看，pKa的变化与Asp向Ala变异所导致的二聚物不稳定程度有关，此外，两者所产生的HdeA变异性也在二聚物融化温度下大量减少。而那些并不会出现如此巨大pKa变化（D20至D51）的其他变异酸性残基则不太会扰乱二聚物融合温度。值得注意的是，对比野生HdeA，D20和D51 HdeA变异体依赖于pH的绑定荧光染料能力（用于检测疏水性暴露程度）在高pH值的环境中显著增强。此外，循环二色性显示，结构性活化的双变异体在中性pH环境中比野生型蛋白显著减少了其二级结构了，而这种变化类似于野生型HdeA在较低pH环境中被激活的状态。最重要的是，这种双变异体在pH 5 时完全阻止了的苹果酸脱氢酶的聚合，在中性pH时则发挥抑制作用，这证实了D20和D51是主要的pH转变的残基。超离心术分析显示，疏水表面的暴露、二级结构的丧失以及伴侣蛋白活性的增强都与野生型HdeA二聚物向单倍体D20A和D51A变异体转化是同时发生的。
那么HdeA是如何作为伴侣蛋白发挥作用的呢？大部分细菌细胞质伴侣蛋白，例如GroEL和DnaK都是利用绑定ATP和水解作用来实现高亲和力和低亲和力状态的转变，并形成一套循环绑定的过程，释放未折叠的基底。这些步骤同时优化了蛋白质折叠并减少了非折叠基底的积聚，降低了发生聚合的风险。而对于HdeA而言，它必须在一个缺乏ATP的外周胞质环境中发挥作用，因此，pH梯度似乎发挥了类似于ATP的作用。在暴露于低pH时，HdeA二聚物快速分离，单倍体随后与许多不同的酸变性的外周胞质蛋白相结合（图1）。这类蛋白包括DegP和SurA这些外胞质伴侣蛋白。而在细菌结束在胃部的“旅行”，又回到高pH值的环境中，会导致HdeA所绑定的那些蛋白以一个相对缓慢的速度释放，从而在较低聚合风险的情况下实现蛋白的重新折叠。若能测定DegP和SurA伴侣蛋白的释放和折叠速率则能检测它们是否有助于其他HdeA结合蛋白的重新折叠。此外，探索HdeB的功能也将非常有意思，该蛋白与HdeA具有许多共性，但其与伴侣蛋白结合的pH范围值却不同。似乎这两种类似的小分子外周胞质伴侣蛋白协同合作发挥着作用。
Foit等研究人员的本次研究结合他们之前的研究成果，指出了HdeA部分折叠与其强化的伴侣蛋白活性之间存在直接的联系。内在无序蛋白（Intrinsically disordered proteins，IDPs）以及内在无序区域的蛋白（Intrinsically disordered regions of proteins，IDRs）最近开始受到蛋白质研究领域的关注。通常来说，3D结构是蛋白质发挥功效的前提，但IDPs和IDRs则违反常规，处于一种多变的状态。IDPs和IDRs在分子识别、信号传导和域间联系等方面发挥着作用，而它们多变的结构则有助于他们杂乱地结合其它蛋白。虽然这些分子蛋白的具体特性和功能尚不明确，但根据HdeA伴侣蛋白活性与其部分折叠单倍体状态有关这一特性，我们可以推测HdeA中的无序区域在HdeA绑定一系列非折叠基底中具有关键作用。这些区域可能与那些在HdeA单倍体时暴露，在二聚物时被隔离的内部亚基疏水表面共同发挥作用，从而介导HdeA与非折叠基底的结合。IDRs被认为参与了协助折叠的工作，而且它们在伴侣蛋白中非常常见：GroES的移动环结构就是典型的IDR；它是GroEL与GroES的作用位点，与GroEL的结合蛋白共享绑定位点，并能模拟这些结合蛋白的特性。GroEL本身非结构化C端序列，该序列被认为不仅与基底互相作用还能作为展性空间填充物来降低GroEL腔大小。热休克蛋白（hot shock protein，Hsp）90的一个无序内区域链接被认为能调控基底的结合。DnaK具有两个IDRs，其内区域链接在变构效应中发挥功效，而C段无序区域则能绑定基底。Hsp33具有一个无序区域能够暴露于氧化还原反应转化模式中从而与基底结合。因此，HdeA成为了能利用无序区域或蛋白发挥其功效的众多伴侣蛋白之一。
Foit等的研究证实了结合计算机模型与良好设计的试验所产生的强大功效。研究人员成果设计了在中性pH环境中具有活性的伴侣蛋白——HdeA突变体，为探索更深层的机制提供了有前景的体系。然而，无序化是否是HdeA的活化形式？是否是蛋白的部分维持着结构，而另一些变得无结构化，或者其活化状态需要发生一种整体的动态变化？我们急切希望能够开展进一步的研究来探索基底结合的方式以及HdeA单倍体的动态变化情况。这些研究结果的揭示都将为无序蛋白和无序结构是如何在伴侣蛋白中发挥作用的提供线索。
（作者：沈颖、罗全伟）
参考文献：《Proceedings of the National Academy of Sciences》2013;110:5279-5280