随着人类对基因的不断认识，对DNA重组技术的熟练掌握，基因治疗也受到了广大医疗研究者的重视，逐步发展得更为完善。最初的基因治疗仅指遗传病的基因替代治疗，即通过某种途径将正常基因转入到由于该种基因缺陷而患某种遗传病的患者体内，达到治疗的目的。现在的基因治疗是指体细胞基因治疗，即将具有防治潜能的外源基因(目的基因)通过合适载体转移到患者的有关器官组织(靶组织)的细胞内，并获得适当表达，以达到防治或减轻疾病的目的。基因治疗的对象不再仅仅是单基因缺陷遗传性疾病，人类许多非遗传性疾病如恶性肿瘤、心血管疾病、神经系统疾病、自身免疫疾病等多基因疾病也涵盖其中，甚至可将能产生对抗病理作用或者加强生理作用物质的基因转入体内细胞或组织，形成抗体“药厂”，达到治疗目的。

基因转移载体系统

体内或体外基因转移都必须借助一定的技术方法或者载体才能将外源基因导入生物细胞。选择恰当的转移方法或者载体系统，不但可以在不同组织高效传递基因，而且还不具有致病性，使目的基因有效地表达，达到治疗目的。目前在基因治疗中用的载体分为两种，即非病毒载体和病毒载体。

非病毒载体

裸DNA注射——将目的基因连接在表达的质粒或噬菌体中直接进行DNA注射而不依赖其他物质的介导，是最简单的非病毒载体系统，其优点是对机体具有低毒、低免疫反应、外源基因整合机率低、无基因插入片段大小的限制以及使用简单、制备方便、便于保存和检验等优势，缺点是基因转移率比病毒载体的效率要低，而且不稳定，需多次给药。已知皮肤细胞、某些肿瘤细胞及免疫细胞对裸DNA较为敏感，可用多种物理操作方法来提高裸DNA的转染效率，物理方法包括电子枪、电穿孔、超声、高压注射等。

自从1987年Feigner等率先用脂质体作为基因转移载体以来，相继合成了许多阳离子脂质体。脂质体或脂质复合物经静脉注射后，很快被血浆清除以及在肺组织中积蓄，蛋白质表达主要在肺内皮细胞，表达时间短，一般在给药后4-24h达峰，1周后消失。因此，阳离子脂质载体在治疗一些肺部疾病如肺代谢性疾病、门脉高压和急性呼吸窘迫综合征等有较好前景。

DNA带负电，可以利用带正电荷的多聚阳离子通过电荷之间的相互作用，与DNA形成稳定的多聚复合物，使得DNA不易被核酸酶降解，并可以与细胞表面带负电荷的受体结合，从而有效地被内吞摄入介导基因转移。常见的阳离子多聚体有多聚左旋赖氨酸、多聚乙烯亚胺、壳聚糖和壳聚糖衍生物以及树状高分子等。

除上述3种非病毒载体外，非病毒载体还包括多肽导向载体系统、纳米载体和嵌合载体。非病毒载体在应用过程中，虽表现出它众多的优势，但它的低转化率限制了临床上的应用。由于非病毒载体是一种新型的载体系统，相信通过对非病毒基因载体基础和应用的深入研究以及方法学上的改进，会不断提高其转化率，利用非病毒基因载体进行基因治疗将会取得最大的临床疗效。

病毒载体系统

人们往往谈病毒而色变，其实病毒并非百害而无一利，至少在基因治疗和干细胞的领域病毒就发挥了不可替代的作用。病毒是比细菌还小、以毫微米为测量单位、没有细胞结构、寄生性严格、只能在活细胞中以复制进行繁殖的一类非细胞型微生物。病毒可以感染特异的细胞，在细胞内不易被降解，种种特性决定了病毒是一种非常好的基因转运载体工具，目前基因治疗的临床试验多采用病毒作为载体。

逆转录病毒载体

到目前为止，已经进入临床应用的基因治疗病毒载体大部分都是逆转录病毒载体，属第一代病毒转运系统。逆转录病毒是一个大的被膜RNA病毒家族，存在于所有的脊椎动物，病毒可高效地感染许多类型的宿主细胞，可使RNA逆转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组中。逆转录病毒是最先被改造且应用最为广泛的基因治疗载体。逆转录病毒表面的糖蛋白能被很多哺乳动物细胞膜上的特异性受体所识别，因而可以高效率地将基因转移到被感染的细胞内，可使近100％的受体细胞被感染，转化细胞效率高，并且此类病毒感染并无严格的组织特异性。被转移的外来基因能整合进被感染细胞的基因组中而不丢失，有利于被转移基因的永久保存，一般无害于宿主细胞。

腺病毒载体

腺病毒载体是继逆转录病毒载体之后在基因治疗中应用比较广泛的一种基因转移载体。到目前为止腺病毒载体己发展到第三代。同其他病毒载体相比，腺病毒载体有诸多优点：首先腺病毒相对稳定，易于进行基因组重组；其次腺病毒安全性好，无需整合进宿主细胞基因组中；同时腺病毒宿主范围广，感染效率高，且制备容易。当然腺病毒载体也有它自己的缺点，如载体基因容量有限。目前在临床上更多应用的是腺病毒载体，如Rosenfeld等人用构建的含肌糖原磷酸化酶cDNA的重组腺病毒感染肝细胞,糖原磷酸化酶活性增加46倍,赋予肝细胞针对效应物的糖原水解反应的能力,提示可以对糖原蓄积疾病进行基因治疗。近年来，随着对腺病毒载体生产技能的不断改进，相信腺病毒载体会得到不断的完善，也许研究人员会找到更成熟、更高性能的新型载体服务于基因治疗领域。

基因治疗的临床应用

19世纪60年代，遗传学家孟德尔就提出了生物性状是由遗传因子控制的观点，但以当时的学术水平只能做一猜测，无法找到确切的证据。20世纪初期，遗传学家通过果蝇的遗传实验，认识到基因存在于染色体上，并且在染色体上是呈线性排列，从而得出了染色体是基因载体的结论。1953年，在沃森（Watson）和克里克（Crick）提出双螺旋结构以后，人们才从结构上真正认识了基因。生物体通过基因的突变适应环境，但基因突变也会造成细胞形态和功能的异常，并不会只产生适者生存的结果。基因突变会导致疾病的发生甚至机体的死亡。以现代医学的观点来说，人体某些疾病的发生与基因的核苷酸序列的变化是紧密相关的，如果能够通过治疗基因，达到治疗疾病的目的，那将是一个标本兼治的好方法。“基因治疗之父”French Anderson博士甚至曾断言：没有任何一项疗法能够像基因治疗那样，为攻克困扰人类健康的重大疾病（如癌症）提供治愈的可能。但一种新治疗方法的产生并非一帆风顺，需要经历曲折的过程，基因治疗也不会例外。

第一个基因治疗思想的产生还要追溯到20世纪60年代。早在1963年，Joshua Lederberg就曾经写过一篇名为《人类的生物学未来》的文章，在这篇文章中Lederberg提到可以在体外培养生殖细胞并和人类的染色体进行交换。Lederberg指出分子生物学的最终应用将是直接控制人类染色体的核苷酸序列，选择并整合我们需要的基因。在1966年， Joshua Lederberg 和Edward Tatum提出了在基因水平上治疗机体疾病或缺陷的设想，并提出基因治疗的基本原则。在1966年5月26日纽约举行的“Reflections on Research and the Future of Medicine”会议上，Tatum指出人类将有效利用病毒为人类造福，并尽可能地应用在基因治疗领域中。这种思想的提出为基因治疗提供了思想基础。在1970年，Rogers进行了人类第一个基因工程试验，当时他将Shope病毒给2个身患精氨酸血症的德国女孩服用。虽然最终试验结果不容乐观，但这个试验仍旧给研究者带来了无数的希望。

20世纪90年代是基因治疗的辉煌年代。1990年9月14日由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH) 的 Anderson、Blaese 和Rosenberg进行了首例获批的人体基因治疗方案。研究人员将腺苷酸脱氢酶（Adenosine Deaminase，ADA）导入一个4岁患有严重复合免疫缺陷（Severe Combined Immunodeficiency，SCID）综合症的女孩身上。研究人员采用的是逆转录病毒介导的间接法，即用含有正常人腺苷酸脱氢酶基因的逆转录病毒载体培养患儿白细胞，并用白细胞介素II（IL-2）刺激其增殖，经过10天左右再经静脉输入患儿。大约1～2个月治疗一次。8个月后，患儿体内ADA水平达到正常值的25%，免疫力明显提高，未见明显副作用。此后又进行了第二例治疗获得了类似的效果。三年后，法国医生对10位SCID患者实施相似的基因治疗。

自此之后，基因治疗掀起了新一轮的研究热潮。肿瘤是危及人类生命的一种疾病，肿瘤对药物不敏感，用传统方法治疗效果不显著。研究人员将治疗肿瘤的希望寄托在基因治疗上。在进行了多方的探索研究之后，发现了肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL，即能在肿瘤部位持续存在而无副作用的一种淋巴细胞）在肿瘤治疗中的作用。在1992年，实施了TNF/肿瘤细胞和IL-2/肿瘤细胞方案，即分别将IL-2基因和肿瘤坏死因子基因导入取自患者自身并经培养的肿瘤细胞中，再将这些培养后的肿瘤细胞注射至病人臀部，3周后切除注射部位与其引流的淋巴结，在适合条件下培养T细胞，将扩增的T细胞与IL-2合并用于病人，结果5名黑色素瘤病人中1名肿瘤完全消失，2名90%的肿块消退，另2人在治疗后9个月死亡。l992年，Jim Wilson团队针对肝遗传性疾病进行了基因治疗的临床试验。在这项试验中，研究人员利用MoMULV逆转录病毒载体对家族性血胆脂醇过多的患者进行肝实质细胞静脉灌注，开创了靶向内部器官基因治疗的先河。

随着基因治疗研究的深入，研究者也开始了基因治疗药物的探索研究。基因治疗药物不同于基因工程药物。基因工程药物是利用“目的基因”在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞表达出所需要的蛋白注射入患者体内达到治疗目的，其最终产品是一种蛋白质。基因治疗药物是将目的基因导入体内，通过基因在体内表达产生蛋白质来达到治病的目的。1999年9月17日，美国宾夕法尼亚大学的基因治疗试验因“临床试验存在违规行为”，使18岁的格尔辛基（Jesse Gelsinger）死亡。尽管是众多临床试验者中唯一明确由基因治疗丧生的患者。但这一事实仍旧震惊了世界，很多激进分子甚至提出了“停止基因治疗临床试验”的议案。虽然最终NIH否决了该议案，但这一事实对基因治疗药物研究是一个沉重的打击，当时很多的研究都被迫停顿下来。各国的研究者都通过大量的临床试验希望找到安全有效的基因治疗药物。在2004年1月20日，中国食品药品监督管理局批准了重组人p53腺病毒注射液用于治疗鼻咽癌等头颈部鳞癌，这是世界首个获批的基因治疗药物，该药物的有效性和安全性还需要进一步的验证及时间的考验。近期，美国科学家开展了全人化TNF-α可溶性受体基因治疗研究，已有200余人入组，虽然有一人死亡，但试验仍在进行。到2009年8月为止，在ClinicalTrials官方网站搜索gene therapy相关试验，世界范围各国批准的基因治疗临床试验项目数已经达到1879项，其中1013项临床研究正处于志愿者招募之中。在载体方面，以腺病毒应用最多；其次为逆转录病毒。

编者

基因治疗是一门年轻的学科，它的发展必然要经历挫折与挑战。基因治疗分为体细胞基因治疗和生殖细胞基因治疗。生殖细胞基因治疗是将外源基因转移并整合到生殖细胞或早期胚胎内并使之表达产物。由于生殖细胞基因治疗会产生一系列的伦理问题，目前尚无临床试验，进行的临床试验均为体细胞基因治疗临床试验。虽然全世界的研究者都抱有乐观的态度，但基因治疗导致的首例死亡案例仍让人心有余悸。随着对分子药物研究的不断深化，基因治疗药物纵使有技术上的难关也终将攻破。目前研究人员迫切需要解决的问题是基因治疗药物的安全性，其次才是有效性。随着技术的不断改进，利用反义技术和RNAi干扰技术也已经用于肿瘤和一些难治性疾病的治疗。