毋庸置疑，蛋白质间的相互作用意义重大。如果这种作用不存在，则细胞中的各项进程也将停滞，包括细胞的分裂、荷尔蒙的分泌或凋亡过程的启动。蛋白互作图谱是了解生物体系运作的最佳方式。现在人们开始寻找能够有效阻断肿瘤细胞或其他疾病中蛋白相互作用的技术，不少生物技术产业也因此兴起了。着眼于蛋白质间的相互作用而非单个的基因或蛋白能够更直接地解释许多生理或病理现象。例如，同一种蛋白突变因其与不同蛋白的相互作用而导致不同的疾病，而不同的蛋白突变破坏同一条相互作用通路将导致相同的疾病。蛋白质互作图谱能够进一步完善人类基因组信息库，并有助于揭秘更多的基因变异和各项功能。波士顿丹娜-法伯癌症研究所的Marc Vidal说道：“一旦这些蛋白质间相互作用的网络被发掘出来，我们将能更精确地鉴定出这些相互作用发生在何时、何地以及为什么会发生。我们对细胞中的运作将有更全面的认识。”
但前文所述的两个小组的研究结果却出乎意料。虽然两组研究人员在同样的生物体中使用了标准的酵母双杂交技术（yeast two-hybrid，Y2H）对所有蛋白质进行检测，但他们仅发现了不到150种的蛋白相互作用，而且两组的结果只有不到10%是一致的。两项研究的结果差异如此巨大，使得他们的研究遭到了大部分科研人员的质疑。事实上，直到今天，还是有不少研究人员对Y2H试验抱有怀疑的态度。
但Vidal为这种差异提出了合理的解释。他认为Y2H试验技术已经存在了几十年，是通过了时间考验的技术。之所以这两项研究结果只有少量的一致性，不是因为他们错了，而是因为他们都只发现了一小部分，还有更多的蛋白相互作用没被发现。
Y2H筛查技术
Y2H技术最初是在1989年由Fields提出来的，它的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究。 GAL4包括两个彼此分离但功能必需的结构域：位于N端的DNA结合域（DNA binding domain，DNA-BD）和位于C端的转录激活域（Activation domain，AD)。DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，但是当二者在空间上充分接近时，例如两种蛋白发生相互作用或发生对接时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活启动子，使启动子下游基因得到转录。Fields建立了一个双杂交系统，BD与X蛋白融合，AD与Y蛋白融合，如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物，使GAL4两个结构域重新构成，则会启动报告基因的转录和扩增。
#p#副标题#e#
这种Y2H技术具有许多优点但也带来了弊端。由于这种技术同样能够检测到较弱的且短暂相结合的蛋白质对，而这些蛋白质可能只是偶然碰撞到一起。这就引发了疑问：“我们究竟如何鉴定所检测到的蛋白质对是通过相互作用来发挥作用的呢？”可喜的是，科学家们在短短几年后找到了应对的方法，能够避免许多假阳性结果。依靠这些方法人们可以鉴定且排除那些能非特异性结合其他蛋白质的“粘性”蛋白，并能识别出通过转录因子重组而非与另一个蛋白结合才诱导生长的酵母细胞。
更精确的筛查系统能够检测出所有科研人员想了解的蛋白质组合。现在不再是单纯地将含有某两种特定蛋白质基因的质粒转染至酵母细胞，而是转染含有某个体基因的质粒，使它们自由结合，然后检测其后代。此外，自动化的系统能够精确地混合不同的酵母并能使每种方案多次重复运行。由此，同样的蛋白相互作用次数能够被量化，而Y2H技术的准确性和可信度也能随之被评估出来。
其他筛查技术
当然，Y2H无法检测所有的蛋白质相互作用。相互作用的蛋白质使得两部分的转录因子重聚，它们必须足够靠近细胞核才能激活报告基因发生转录。因此，那些位于细胞膜或细胞器特殊位点上的蛋白质结合就无法被检测到。
除了Y2H，另有一些技术能够用来筛选哺乳类细胞中的蛋白质相互作用。这包括发荧光标记哺乳动物相互作用组定位方法（luminescence-based mammalian interactome，LUMIER）、哺乳动物蛋白的蛋白质相互作用陷阱（mammalian protein–protein interaction trap，MAPPIT）、蛋白质阵列和蛋白质片段互补分析（protein arrays and protein-fragment complementation assay，PCA）。
MAPPIT是一项高通量的哺乳动物细胞筛选技术。该技术不是利用酵母转录因子而是利用一种哺乳动物的细胞因子受体。这种细胞因子被一分为二，只有两者重聚才能产生细胞信号。2009年，这种技术得到了改进。比利时的网络生物学家Jan Tavernier将能够编码潜在结合蛋白且含有一半细胞因子受体片段的质粒储存在多孔细胞板内。实验时，只要将表达“诱饵”蛋白质和另一半细胞因子受体的细胞加入这些孔内，一旦蛋白质发生相互作用，则信号通路就被激活，随后研究人员可以观察到荧光霉素发光。通过多孔细胞板检测一种“诱饵”蛋白预计需要2000欧元的花费，而Tavernier正在努力改进技术，期望研发微芯片可以将小型研究方案的费用降低至100欧元，并且每周能检测100种“诱饵”蛋白质。在这种通量水平和成本的基础上，Tavernier认为这种新技术能够跳脱酵母细胞的局限，应用于检测其它物种中的蛋白互作图谱。此外，Tavernier还打算检测在药物的刺激下，蛋白质相互作用是如何变化的。他希望能够将这种技术产业化，并正在与Vidal等其他科研人员共同致力于人类蛋白质互作图谱工程。
#p#副标题#e#
LUMIER技术同样具有较高的通量，而且能被用于检测某些药物、荷尔蒙和其他添加物是否会影响某些蛋白质的相互作用。该项技术中，细胞被暂时转染两种蛋白质。其中一种蛋白质附带一段亲水性多肽——FLAG。另一种可能结合的蛋白则连着荧光霉素。当细胞被溶解后，两蛋白一旦结合就能产生荧光。
而蛋白质互补分析技术则能够被应用于酵母或其他哺乳细胞中，主要是依赖于多种“报告者”的重组，通常是某种酶或者荧光蛋白。由于这些报告者能够在细胞各处发出信号，因此蛋白质相互作用的发生位点能通过这种技术被检测到。
通过收集和分析2009年期间所有关于蛋白质相互作用组的筛查研究，科学家们能够形成一套体系来评估筛查所得的蛋白质相互作用组的可信度。首先挑选100种已知的蛋白质相互作用组作为阳性对照组，随后再随机挑选100种首次被发现的相互作用组。理论上而言，某种蛋白质相互作用组能被越多种筛查技术所鉴定，那么其可信度就越高。而该项对照研究显示，这些筛查技术只检测出大约70%的阳性相互作用组。
高通量技术不是鉴定蛋白质相互作用组的唯一途径，生物信息学的研究手段同样重要。通过分析一些数据库，例如相互作用数据库和InAct的生物通用储存库文献中所报道的蛋白质相互作用组，相互作用科学家根据研究结果预测潜在的相互作用组，将其编制为列表。但完成这份列表尚需大量的工作。欧洲生物信息研究所的蛋白质组学家Sandra Orchard说道：“如果目前我们所发现的酵母体内蛋白质相互作用组已经达到实际总量的30%，那么我们就该大感庆幸了。”她估计这些蛋白质相互作用组仅占人体内的10%不到。
#p#副标题#e#
如何鉴别“真伪”
科学家们在几个方面需要应用这些相互作用的数据。他们通常将蛋白质互作网络和其他生理网络系统结合起来。例如，在鉴定调控某基因的转录因子后，他们通过搜索相关数据库和文献来寻找这种转录因子的相互作用对象。研究者还常常探索蛋白质之间是如何相互作用的，随后根据蛋白质的作用情况进行分类。
正如前文所述，人们普遍认为，蛋白质相互作用组被多种方式检测出来才是可信的。然而，韦恩州立大学的网络生物学家Russell Finley提出，这种观点存在偏倚。因为有些蛋白质是科研人员高度感兴趣的，它被检测的几率也就更高。Finley认为应该考虑所有潜在的可能性，而且利用计算机设立某种评分制度来判定某种相互作用组是否是真实可信的。
蒙特利尔大学的生化学家Stephen Michnick则提出了另一方面的观点。他说道：“我们首要需关注的是哪种蛋白质相互作用是具有重要生理意义的。有些蛋白质相互作用组能被多种筛查方案所检测，但却不具有生物功效。”Michnick是在进行了一项复杂的筛查研究后得出此结论的。在这项研究中，他们利用PCA技术在酵母体内鉴定了3000种新的相互作用组，其中许多位于细胞膜和其他无法接触细胞核的位点。但同时，他们还发现了其他数千种蛋白质相互作用组。Michnick惊叹道：“我们已知的那些蛋白质间竟然存在如此多的相互作用关系，而还有许多相互作用是不具有生理意义的，这太让我们吃惊了！我们本以为通过最佳的方案，我们应该能够得到最优的结果。如果我们所观察到的是‘垃圾’相互作用组，而其他研究者也同样观察到了，那么还有哪些是‘垃圾’？”他认为，也许这些“垃圾”相互作用组是自然存在的，本就不具有功效。他猜测我们所观察到的相互作用组几乎有一半是这种不具生物功效的“垃圾”。但如果有一对蛋白质始终是以配对的方式被发现，而不与其他蛋白质相结合，那么这对蛋白质间的相互作用很可能是真实有用的。
而加利福尼亚大学的网络生物学家Trey Ideker更担忧在如此少的相互作用组被鉴定的情况下，科研人员很难不偏倚地找到具有生物功能的那些相互作用组。他比喻道：“我们只照亮了院子20%的面积，而其余80%是黑的。这个蛋白质互作图谱究竟有多大没人知道，但我们所有人都意识到，我们还远没有接近成功。”
数据的整合
针对这种现状，研究人员采取了扬长避短的措施。其中一种策略就是以某个问题为中心来整合各种数据，集中进行解决。例如，Ideker决定采用某种Y2H筛查技术来找出参与MAPK信号通路的蛋白质间的相互作用关系。该信号通路调控着细胞生长、分化和存活等生理过程，是一种重要的药物靶点。Ideker及其同事挑选了150种与该通路相关的蛋白质，并利用Y2H开始查找与它们相互作用的蛋白质。通过这种方法，他们在1500种蛋白质中发现了2000多种相互作用关系。
随后，他们从这1500种蛋白质中挑选出十几种与MAPK通路无关的蛋白（根据之前的研究报道），并用RNA干扰技术敲除与其相互作用的蛋白质的表达，结果发现有2/3的RNA敲除会导致MAPK通路中相关基因表达的改变，这表明这些蛋白之间的相互作用影响着MAPK通路。进一步的研究首次发现一种叫NHE-1的蛋白质是MAPK的支架蛋白。Ideker认为，通过探索蛋白质间的相互作用，并将这些蛋白质挑选出来进行研究，将有机会开拓许多新的生物学领域。
而康奈尔大学的Haiyuan Yu及其同事则通过研究蛋白质互作以及蛋白质结构来解释变异是如何导致疾病的。他们整合一些已知的蛋白质互作关系及其这些相互作用的结构，利用基因检测的方法来证实，即使基因变异未导致蛋白质的缺失，仍然能够通过改变蛋白质之间的相互作用而致病。
德国海德堡欧洲分子生物实验室的Anne-Claude Gavin说：“蛋白质之间的相互作用必须发现和终止于特定的时间点。这些相互作用是否发生在特定的细胞中或在特定的情况下将影响它们的功能。”探索蛋白质相互作用的特定环境是一项艰难而复杂的工作，目前相关的研究还非常少。研究者必须分离出这些蛋白质，进行深入探索。
有时候一些筛查技术能够对某种蛋白质相互作用进行追踪探索。例如荧光蛋白或荧光素酶能用来追踪互作蛋白。利用不同的颜色标记不同的蛋白质，某一种蛋白质与不同蛋白的相互作用可以在同一个细胞中进行检测。此外，一些成像技术，例如生物发光共振能量转移和荧光共振能量转移，能被用于活细胞中的蛋白质检测。
总而言之，虽然一次只针对某种特定蛋白质相互作用的集中研究比大规模筛查效率低、耗费多，但它是必需的，因为只有深入探索才能各个击破，解开每种互作组的作用条件和功效之谜。
（作者：沈颖、李秋实）
参考文献：《Lancet》2012;379:1665-1675