植物具有表达异源蛋白的能力，这催生了将植物作为“生物反应器”或“生物工厂”来生产药物蛋白的理念。尽管最初的研究看似前途无限，但通往商业化和临床应用之路并非一帆风顺。本文综述了近期利用植物产生药物蛋白（尤其是在临床试验背景下）的技术进展。
二十世纪八十年代，在植物体内有效表达多种异源蛋白（非植物蛋白）的技术取得进展，这让人们看到了利用植物作为生物反应器为人类及动物提供低成本药物的希望。此外，植物细胞培养物对哺乳动物病毒病原体不敏感，植物病毒也不会感染人类细胞。早期研究表明，在转基因烟草中可表达正确组装、功能性的人类抗体，这提示植物中产生的哺乳动物蛋白将保留研究者所需的药物性质。这一初步成功之后，又很快在转基因植物中成功表达乙型肝炎病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）、更复杂的抗体衍生物[如分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，sIgA）]和口服免疫原性蛋白质。同时，植物病毒载体被用于抗原肽的表达，该抗原肽通常融合于病毒外壳蛋白。在数个实例中，组装的颗粒能保护动物免于病原体的攻击。本文将回顾过去25至30年间在实现药品生产这一终极目标过程中是如何取得进展的，何种技术进步帮助了这一目标的实现，以及还有哪些方面有待突破。
表达技术的进步
稳定转化技术（可再生植株）在植物作为生物反应器的开发过程中发挥了重大作用，具有大规模生产的潜力，适用于广泛的植物物种。然而，该技术也有缺点，即劳动密集和耗时。因此，这一领域的大部分早期工作集中在既往已在其他系统中成功制造的分子的生产上。此外，生产时间长意味着这些技术不适合快速生产药物来对抗新出现的疾病。
基因传递技术的重大转变涉及利用农杆菌，通过渗透法将基因传递至体细胞组织中，以及依赖于瞬时表达技术在数日内生产所需蛋白质。由于导入的序列不可遗传，这本质上是一个批处理过程；扩大生产涉及渗透更多的组织。因此，使表达程度最大化尤为重要，这要么通过使用复制病毒RNA来增加mRNA水平来实现，要么确保mRNA能最大程度地稳定和翻译。此外，开发可以大规模应用的技术非常重要。常规用于瞬时表达的植物物种是本氏烟（一种来自澳大利亚的烟草野生近缘种），其生长速度快，特别适合于渗透，并且似乎具有缺陷的RNA沉默系统。使用这种方法，在5到7天内每公斤叶子可以达到1克产品的产量，尽管表达水平是蛋白依赖性的。
作为使用整个植物的替代方案，近来在使用植物细胞培养物（如烟草BY-2细胞和胡萝卜悬浮培养物）方面的研究取得了相当大的进展。这种悬浮培养方法在控制生长条件方面具有数种潜在优势，并且与传统的药物生产方法（例如哺乳动物、昆虫和酵母细胞培养）具有更大的相似性。相反，这些方法的高成本可能会让植物生产的经济优势消失殆尽。为了克服这一缺点，科学家开发了用于大规模生产植物细胞悬浮培养物的完全一次性系统。从悬浮培养物中生产细胞包（cell packs）的方法也得以开发。除了使用来自高等植物的悬浮培养物外，科研人员对使用更简单的或单细胞植物培养物的可能性也进行了探索。
以上所述可能给人的印象是，基于植物的表达领域各自为政。这在过去的确如此，最近几年才趋于一致；尽管各种技术的细节可能不同，但许多工具可以互换使用。因此，许多农杆菌双元载体可用于稳定表达和瞬时表达，以及将序列导入整个植物或悬浮培养物中。在开始生产转基因株系前，叶片中的小规模瞬时表达通常用于表达新的分子。
在植物中成功生产的药物蛋白的主要类别
到目前为止，植物中生产的主要药物蛋白类别是抗体、亚单位疫苗和VLPs，以及治疗酶。 然而，其他类型的分子（如毒素）也得以表达。已经成功地表达了多种抗体和抗体衍生物（包括sIgA和IgM），以及许多IgG分子。同样地，也已经产生了源自多种哺乳动物病毒的多种VLPs。这其中包括仅由单一类型的衣壳蛋白组成的VLPs、由数种衣壳蛋白组成的更为复杂的VLPs、其形成需要成熟步骤的VLPs以及来自包膜病毒的VLPs。虽然VLPs在不同系统中表达的例子很少被直接比较，但乙型肝炎病毒VLPs的相关研究表明，植物特别适合组装高质量的均质颗粒。旨在治疗代谢性疾病（如Gaucher病和Fabry病）的几种治疗酶也已被成功表达。2012年，用于治疗Gaucher病的taliglucerase alfa成为第一个获得美国食品药物管理局许可的人用植物源型生物药。
植物源性生物药的临床开发
用于口服给药的疫苗是第一代实现临床开发的、植物生产的生物药蛋白。在生产系统由转基因植物主导之时提出了可食用疫苗的概念，其想法是抗原可以在转基因水果、块茎或种子中表达，并且不经纯化地口服，减少肠胃外给药、制剂和（可能的）冷藏的需求。因此，可食用疫苗具有能负担得起、便于给药以及在欠发达地区易于获得的潜力。
首个植物生产的药物的人类研究评估了对摄入含有大肠杆菌热不稳定性肠毒素B亚基的转基因马铃薯块茎的免疫应答。这项研究首次表明，口服可食用植物中的抗原可诱导粘膜和全身免疫应答。然而，该结果突显了免疫应答的持续时间短的特点。在随后的研究中也观察到类似的中等时间和短暂的免疫应答。尽管食用疫苗面临着早期的挑战，但在食用植物组织中传递生物治疗药物的想法仍然存在。最近提出的被动口服免疫治疗方案建立在植物能产生sIgA（黏膜免疫的主要成分）的基础之上。
植物生产的生物治疗剂在人类中的肠胃外给药首先在2000年前后由Large Scale Biology公司进行，他们通过复制载体来利用瞬时表达。这项开展数年的1期临床研究评估了纯化的独特型（idiotypic）疫苗（约30-kDa多种单链可变区片段）治疗非霍奇金淋巴瘤的需哦啊过。抗原的纯化允许该研究小组控制给予的抗原剂量。它还能够利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子作为佐剂来评估佐剂疫苗剂量。
Protalix Biotherapeutics投资了使用植物细胞培养物来生产生物药物[包括talglucerase alfa（β-葡糖脑苷脂酶）]这一替代策略。治疗性葡萄糖脑苷脂酶的最佳生物活性需要通过结合其巨噬细胞的甘露糖受体来实现。因此，糖基化酶需要携带具有末端甘露糖残基的N-聚糖。Shaaltiel等通过将酶靶向作用于贮藏液泡，在植物中实现了N-聚糖成熟为一种寡甘露糖结构（具有两个末端甘露糖）。这种方法是有效的，减少了N-聚糖的纯化后成熟的需求，从而改善了这一过程的成本效益，使之高于伊米苷酶（思而赞）（CHO细胞生产的β-葡糖脑苷脂酶）的成本效益。taliglucerase alfa的关键临床试验显示无严重的不良事件，并且显示出与治疗Gaucher病的其他酶替代疗法类似的联系。
猪（H1N1）流感疫情暴发再次凸显了传统疫苗生产技术的局限性，这促使了Medicago利用瞬时表达快速生产基于流感VLPs的大流行性H5N1疫苗。含佐剂疫苗在所有剂量下均具有良好的耐受性，免疫原性研究显示了明确的剂量反应关系。随后采用单价和四价流感疫苗进行临床研究，证实了对流感的强抗体应答，并且已有结果显示，植物源性流感VLPs即使在没有佐剂的情况下也可引起明显、持久、交叉反应性的多功能性CD4+ T细胞应答。在1期和2期临床研究中接受H1或H5 VLP疫苗的280名受试者中，未发现过敏反应或超敏反应，尽管具有植物特异性N-糖基化特征的病毒表面糖蛋白、血凝素可用作抗原。在健康成年人和老年人中正在进行的四价季节性流感疫苗的2期临床试验旨在确定最佳剂量，建立超过目前流感疫苗在防止异源毒株方面的潜在竞争优势，并为将来制定研究方案提供支持。
另外一个重要的临床进展来自瞬时表达的独特型疫苗的研究。基于既往植物生产针对B细胞滤泡性淋巴瘤的个性化疫苗的研究结果，以及从第一代产品面临的挑战中汲取的经验，Icon Genetics研究了第二代独特型疫苗，以全尺寸人IgG1的形式与匙孔戚血蓝蛋白偶联，由改进的瞬时表达平台生产。对于该特定产品，平台提供了个性化肿瘤靶向特异性疫苗生产和人体给药所需的稳健性、产量、速度、成本效益和质量。该研究表明，独特型疫苗耐受性良好，因为未观察到与疫苗接种相关的严重不良事件。在研究结束时可进行评估的患者中，82%表现出疫苗诱导的独特型特异性的细胞和/或体液免疫应答。
虽然在动物研究中已对数种植物生产的抗体进行了评估，但只有少数已经用于临床开发。最近，Yusibov等人对植物和藻类生产抗体这一领域进行了综述。植物生产的抗体的早期临床开发包括针对变形链球菌的杂交分泌性IgA-IgG抗体，用于治疗龋齿；以及一种在玉米中生产的针对上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion Molecule，EpCAM）（一种结肠直肠癌的标志物）的全长IgG，即Avicidin。这两者已都到达临床2期。此外，旨在用于局部应用以防止HIV感染传播的植物表达的IgG，即2G12，也已经进行了1期临床试验。
虽然首批临床研究是用转基因植物生产的抗体进行的（当时唯一的可用技术），但现在，瞬变表达则更为常用，这不仅是因为上述优点，而且还因为已经开发了糖工程化的本氏烟植物，可生产具有改善的效应子功能的抗体。在西非埃博拉病毒暴发期间开发的用于治疗埃博拉病毒感染的ZMapp抗体混合物（cocktail）以体恤用药的方式给予15名病人，这是通过糖工程改善植物生产的抗体效价的一个很好例子。该抗体混合物源自Mapp Biopharmaceutical和LeafBio（加利福尼亚州圣地亚哥）、Defyrus（加拿大多伦多）、美国政府以及加拿大公共卫生局的合作研究，是在本氏烟草植物中生产的，敲除了植物特异性糖基转移酶（β1, 2-木糖基转移酶和α1, 3-岩藻糖基转移酶）；前代抗埃博拉抗体和抗体混合物的研究表明，非岩藻糖基化抗体显示出更高的效价，这有可能是通过效应子功能改善来实现的。2016年初，Mapp Biopharmaceutical的商业部门LeafBio发布了首个ZMapp治疗的人类研究的结果。所获结果表明，该产品耐受性良好，治疗组的死亡率似乎比非治疗组低40%，尽管这一差异在这样小的样本量中无统计学意义。
未来展望
套用17世纪的英国诗人约翰·多恩（John Donne）的一句话，没有一个科学的分支能自成一个领域。因此，未来植物源性药物生产领域的发展方向，可能会由该领域的发展以及其他生物科学领域的进步共同主导。最近的基因组编辑技术的发展很好地证明了这一点，特别是最初在非植物生物体中开发的CRISPR-Cas9系统，现在正在越来越多地用于修饰宿主植物的表达。完全不同的科学分支的发展也可能影响植物作为表达系统的吸引力（例如，最近发光二极管技术的发展降低了提供了保障植物有效生长所需的照明成本）。本文中提到的临床发展清楚地显示了基于植物的生产系统为广泛多样的产品提供高质量的有效生物药物的能力，包括了从预防性疫苗到治疗性人类酶的替代疗法。现今，通过瞬态表达技术实现的快速生产，结合上述转化技术的应用，正在进一步加速平台和产品开发，以满足对新型和创新疗法的日益增长的需求。
 （作者：张鹏）
参考文献：Science 2016;353:1237-1240