在人类基因组已被加以注解的近
25000个基因中，3000个基因的突变被证明与疾病相关，越来越多的疾病相关遗传变异也正以惊人的速度被揭示出来。如今，由于测序技术的成本不断下
降、人类基因组计划的完成以及个人疾病基因组测序数据的几何级增长，人类健康的遗传学数据已经成为研发、临床医学以及靶向治疗的主要关注点。这些疾病遗传
学基础知识的不断发展，使得我们对于疾病机制的理解越发深刻，并直接剑指潜在的治疗策略。虽然各种治疗假说和药物研发工作正在蒸蒸日上，但具有很强遗传学
作用的小分子治疗药物却鲜有成功。能对细胞和组织进行核酸修饰的治疗药物具有治疗单基因、高外显率疾病（如重症联合免疫缺陷、血友病以及一些酶缺陷病）的
潜力，这主要是由于这些疾病的遗传基础已经非常明确，而且也缺乏安全、有效的替代治疗方法。
目前，两项最有力的遗传学治
疗技术是：①基因治疗，该技术通过病毒转基因表达来修复丢失的基因功能；②RNA干扰技术（RNA
interference，RNAi），该技术通过抑制目标mRNA来介导对缺陷基因的抑制。通过将功能性基因整合至造血干/祖细胞基因组内，基因治疗已
经被成功用于治疗某些造血系统单基因退行性疾病，例如重症联合免疫缺陷（severe combined
immunodeficiency，SCID）和Wiskott-Aldrich综合征。而RNAi技术已经在临床试验中被用于抑制与癌症、年龄相关黄斑
变性以及甲状腺素运载蛋白（transthyretin，TTR）相关淀粉样变性等疾病相关的基因功能。虽然取得了一定的进展，但基因治疗和RNAi技术
仍存在局限性，导致这两项技术无法在许多其他疾病中发挥效用。例如，病毒基因治疗可能会引发插入位点的突变，从而导致基因转录表达的调节异常。同
时，RNAi技术的应用也仅局限于抑制那些“无关整体健康”的基因。此外，由于某些疾病需要完全消除问题基因的功能，而RNAi技术往往不能完全抑制基因
表达，因此不太可能给这类疾病带来获益。RNAi技术的特异性或许也并不理想，并因此产生了潜在的安全性问题。
基于可编程核酸酶（如锌指核酸酶、转录激活子样效应物核酸酶以及CRISPR相关核酸酶Cas9）的基因组编辑技术，正在开启对病态细胞和组织进行治疗性基因组编辑的可能性，从而实现消除、纠正有害突变或插入保护性突变。
基因组编辑技术
可编程核酸酶使得在具体遗传
位点上通过使DNA双链断裂（double-strand
break，DSB）实现基因组的精准编辑成为可能。DSB随后会在DSB位点启动非同源性末端连接（non-homologous
end-joining，NHEJ）或者是同源性修复（homology-directed
repair，HDR）的内源性修复机制，从而介导基因组编辑。
目前，主要的4类核酸酶——大
范围核酸酶（meganuclease）及其衍生物、锌指核酸酶（zinc finger
nuclease，ZFN）、转录激活子样效应物核酸酶（transcription activator-like effector
nuclease，TALEN）以及CRISPR相关核酸酶Cas9，已经能够用于位点特异的基因组编辑了。基于它们识别DNA的机制，这些核酸酶可粗略
地分为两类：ZFN、TALEN和meganuclease通过蛋白-DNA相互作用来实现特异的DNA结合，而Cas9则是通过短链RNA引导分子（碱
基配对）和蛋白-DNA相互作用来靶向特异的DNA序列。
Meganuclease是
拥有较大识别位点（>14bp）的核酸内切酶，它的DNA结合结构域也负责对靶序列的剪切。ZFN和TALEN则是嵌合型酶，由FokI核酸酶结构
域和DNA结合结构域融合而成。对于ZFN和meganuclease而言，靶点的重新定位需要改造蛋白质，而TALEN的靶点重定位则需要进行复杂的分
子克隆。相反，Cas9蛋白是不变的，因此只要改变与其相伴的导引RNA的序列，就能较为简单地实现靶点的重定位。Cas9的其他优势还在于，通过表达不
同的导引RNA，Cas9能够在同一细胞中引起多个DSB。所有4类核酸酶都已证实能够在许多生物和哺乳动物细胞中有效地进行基因组编辑，而现在，无论是
行业内还是学术界都把这个技术作为重要的治疗工具来研究。
DSB所形成的损伤会引发
NHEJ或HDR修复（有赖于细胞状态和修复模板，见图1）。NHEJ能够通过直接重新连接两个DSB的末端来修复损伤，无需修复模板。尽管NHEJ介导
的DSB修复可以准确，然而跨断裂部位往往会出现插入或缺失突变（insertion or deletion
mutation，indel）。Indel一旦进入编码基因就会造成移码突变，从而导致mRNA降解或者无功能蛋白的产生。因此，NHEJ应该和
RNAi技术一样，用于抑制基因功能。但是，由于会在细胞靶基因中引入失能突变，因此可能会导致基因功能的永久性失活。
相比之下，HDR则允许利用
外源性DNA模板来人为“规定”DSB修复的结果。引起靶DSB后，HDR机制会利用与断裂位点相似的外源性单或双链DNA模板来合成DNA以修复损伤。
例如，HDR和经过合理设计的修复模板一起，对突变基因进行直接的替换，从而在保留原有基因表达调控的前提下修复基因功能。
治疗性基因组编辑策略
很多方法都能实现基于基因组编辑的治疗，包括纠正或失活有害突变、引入保护性突变、加入治疗性转基因以及破坏病毒DNA。
致
病突变能够粗略地分为两种，即导致基因产物获能和失能的突变。获能突变（如亨廷顿舞蹈病HTT基因中以及软骨发育不良FGFR3基因中所发现的获能突变）
会导致病基因产物的表达。利用NHEJ介导的修复则能够特异地使突变基因失活，从而达到治疗目的（见图1a）。此外，该治疗策略或许还能用于治疗核苷酸扩
张性疾病，如脊髓小脑型共济失调、亨廷顿舞蹈病和家族遗传性共济失调。具体而言，就是利用基于NHEJ的方法对致病性的插入基因进行删除——在其两端制造2个DSB（见图1b）。如果设计几个DSB的组合，那么就有可能对多个位点进行编辑，从而达到治疗目的。
然而，一些获能突变（例如一
些肌萎缩性脊髓侧索硬化症患者的SOD1
G93A突变）是点突变，这种突变与正常同源染色体上的功能性等位基因间的差异并不足以被目前的可编程核酸酶识别，此时使用NHEJ靶向纠正突变，就很可
能导致蛋白功能的完全丧失。在这种情况下，HDR却能将获能突变纠正为野生型序列，从而修复基因功能，并在确保原有基因表达水平的同时，去除其致病性（见
图1c）。同样地，失能突变也要求通过精准操纵序列来去除致病性，因此就需要HDR的基因纠正能力来将失能突变逆转为野生型序列。
对于有害的失能突变和保护性
的获能突变，可以分别通过引入野生型基因拷贝和获能突变来达到治疗效果（见图1d）。治疗性转基因能够插入到新的位点，如已经发现的“避风港”位点（指那
些即便被打开也不会造成明显表型改变的基因组区域），来修复丢失的基因功能。基因插入也能使得细胞获得新功能来抵抗疾病，比如在T细胞中插入嵌合抗原受体
（chimeric-antigen
receptor，CAR）来治疗某些白血病。这种基因插入策略与病毒介导的基因治疗类似，但是对于转基因的拷贝数和表达水平具有更好的控制。
可编程核酸酶也能够靶向外源DNA，例如病毒基因组。由于病毒的DNA序列与宿主基因组的相似程度很低，因此，相比靶向内源性位点的基因编辑，这类治疗策略出现脱靶的几率更小。
基因编辑技术已经成为当下治疗发展的热点。虽尚未成熟，但其能够攻克许多疾病的潜力着实让人着迷。如今，基础科学和临床应用的发展速度惊人，基因编辑技术的前路似乎不再是迷雾笼罩。
（作者：马驰、李秋实）
参考文献：Nature Medicine 2015;21:121-131