三年前，科学家报道了CRISPR技术，该技术能精确、有效地在活的真核细胞中对基因组进行编辑。自那以后，该方法以风暴般的速度席卷了整个科学界，从生物医药到农业领域，有数以千计的实验室采用了该方法进行研究。然而，这项研究的发现和发展历程：从发现一种陌生的微生物重复序列开始，到被认为是一种适应性免疫系统，随后其生物学特性为人们所了解，到最后开发成基因工程技术，并不为多数人知晓。今天，就带大家走进CRISPR的历史，了解它的前世今生。

概要

CRISPR可以说是一种革命性的技术，没有任何一种技术能如CRISPR这般快速横扫整个生物学界。三年前，科学家报道了CRISPR系统，这是一种适应性免疫系统，微生物利用该系统可以防止病毒入侵，通过记录和靶向病毒DNA，来不动声色地切除病毒基因。在活细胞、哺乳动物基因组和其他器官内，可以将CRISPR系统发展成一种简单、可信的编辑技术。该技术随后被广泛应用，如：创建了复杂的人类遗传疾病和癌症的动物模型、开启或关闭某个基因等。CRISPR技术可能用于修饰人类生殖细胞系的前景也在国际上引起了争论。

几乎所有的分子生物学家都听说过CRISPR技术。但是，真正知道这场革命是如何发生的人却寥寥无几。科学家只关注该技术的未来应用，至于这项技术是如何发现的，并不是他们关注的内容。发现过程往往只是普通人茶余饭后的谈资而已。但是，科学发展背后的故事能带来更多的灵感，让科研人员对于驱动着生物医学进步的、令人惊讶的生态系统有更深的了解。那么，现在就来了解CRISPR技术的前世今生，以及CRISPR技术的榜上英雄。

CRISPR技术的发现

第一个故事发生在西班牙科斯塔布兰卡（Spain’s Costa Blanca）的地中海港口圣波拉（Santa Pola），那里有美丽的海岸和广阔的盐沼，几个世纪以来吸引了众多的游客、盐商还有火烈鸟。Francisco Mojica就在附近长大，经常在海岸边出入，因此，在1989年，他在位于海岸边的阿利坎特大学读博士时，选择在实验室进行极嗜盐菌属（Haloferax mediterranei）的研究工作就毫不意外了。Haloferax mediterranei是一种从圣波拉沼泽中分离出的极端耐盐性的古细菌。他的导师发现，培养基的盐浓度会影响限制性内切酶切割微生物的基因组的方式。Mojica开始研究改变了的片段的特征。在他研究的第一个片段里，Mojica发现了一种稀奇的结构：一种近乎完美的重复序列，该序列与任何已知的微生物家族中的重复序列都不同。这个28岁的学生被深深吸引，在他职业生涯之后的十年里，他都在试图解开这一谜团。他很快发现，在亲缘关系相近的H. volcanii和关系更远的噬盐古菌中有类似的重复序列。通过阅读科学文献，他发现，这可能和真细菌有关。在1987年的一篇文献中，日本团队发现大肠埃希菌中有结构相似的重复序列，但是与极嗜盐菌重复序列并不相似。该文的作者没有继续研究，但Mojica意识到，在关系较远的微生物中出现如此相似的结构对原核生物来说必然意味着一项重要功能。Mojica在去牛津做短期博士后学习之前，于1995年撰写了一篇论文，报道了这一类新的重复序列。

之后，Mojica回到阿利坎特大学担任教员，因为没有启动资金和实验室，他只好通过生物信息学来研究这一奇怪的重复序列，他给重复序列命名为短间隔重复序列（short regularly spaced repeats，SRSRs），随后这个名称在他的建议下进行了更改，命名为成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，CRISPR）。到2000年，Mojica已经在20个不同的微生物中发现了CRISPR基因位点，包括结核分枝杆菌、艰难梭菌和鼠疫杆菌。在两年时间里，研究人员对微生物中是否含有这一基因位点进行了普查，并且记录了这一基因座的关键特征。

但是，CRISPR系统的功能到底是什么哪？有人猜想，该系统有不同的功能，包括基因调控、复制子分配、DNA修复和其他的作用。但是这些猜想没有证据支持，都被证明猜错了。就CRISPR的发现而言，最重要的洞察力来自生物信息学。

CRISPR是一个适应性免疫系统

2003年的暑假，Mojica逃离了圣波拉的酷热，躲到了阿利坎特大学的空调房里。截至2003年，Mojica已经成为早期CRISPR领域的大咖级人物，他的研究重点已经由重复序列本身转移到了分离重复序列的间隔序列上。利用文字处理器，Mojica费力地抽出每一个间隔序列并将其插入BLAST程序里，研究其与已知DNA序列的相似性。他进行的这项研究之前从来没有成功过，但是随着DNA序列数据库的不断扩大，这一次他挖到了金矿。在最近一次从大肠埃希菌测序得到的CRISPR基因位点上，其中一个间隔与一种P1噬菌体的序列相匹配，而这一噬菌体可以感染许多大肠埃希菌。然而，携带这一间隔的特殊菌株对P1噬菌体感染具有抵抗力。在那周结束时，他已经找到了4500个间隔。其中有88个间隔序列与已知序列相似，有三分之二的间隔序列与病毒或拼接质粒相匹配。Mojica意识到，CRISPR位点肯定编码了用于适应性免疫系统的一个指令，防止微生物特异感染。

Mojica和同事一起外出庆祝，并在第二天返回办公室撰写论文。因为意识到这项发现的重要性，Mojica将论文投给了《Nature》杂志。2003年11月，《Nature》杂志在没有外部评审的情况下就拒绝了该论文。而且，《Nature》的编辑声称，论文的主要观点已经众所周知。2004年1月，《Proceedings of the National Academy of Sciences》杂志认为该论文缺乏充足的新颖性和重要性，不够资格进行审评。同样，《Molecular Microbiology》和《Nucleic Acid Research》 也相继拒绝了该论文。此时，绝望的Mojica很担心该观点被别人提前发表，所以Mojica把论文投给了《Journal of Molecular Evolution》杂志。经过12个月的评审和修正，报告了CRISPR可能具有的功能的文章最终发表在了2005年2月1日出版的杂志上。

大约同一时间，CRISPR也吸引了另一个人的关注：Giles Vergnaud，人类遗传学家，他的博士和博士后研究受到了法国Direction Générale de l’Armement的资助。1987年，他完成学业，加入政府部门，组建了自己的第一个分子生物实验室。在之后的10年里，Vergnaud继续他的人类基因组研究。但是，到了20世纪90年代后期，情报部门更加关注伊拉克萨达姆政权发展生物武器的情况。在这种情形下，1997年，国防部要求Vergnaud和他的研究团队将研究重心转向法医微生物学，研究可以追踪病原体来源的方法。在联合实验室里，他开始使用串联重复序列多态性方法来绘制炭疽和鼠疫的细菌种类。

法国国防部获得了特殊的、来自1964年至1966年、越南鼠疫暴发期间的61个鼠疫杆菌样本。Vergnaud发现，除了一个位置不相同以外，这些密切相关的分离株在串联重复基因位点上是相同的，不相同的这个位置是由他的同事Christine Pourcel发现的CRISPR基因位点。菌株由于出现新的间隔而偶尔不同，这些间隔常常以极化的形式出现在CRISPR基因位点的前端。值得注意的是，许多新间隔与存在于鼠疫杆菌基因上的原噬菌体相配。他们推断，CRISPR基因位点是作为一种防御机制而存在的，也就是说“CRISPR可能表示了‘过去的遗传攻击’的记忆” 。Vergnaud试图发表论文的过程和Mojica一样，遇到了相同的阻碍。他的论文被《Proceedings of the National Academy of Sciences》、《Journal of Bacteriology》、《Nucleic Acids Research》以及《Genome Research》杂志陆续退稿，直到2005年3月1日才发表于《Microbiology》杂志上。

最后，第三名研究者Alexander Bolotin，是一位俄国微生物学家，他在法国国家农业研究院工作。2005年9月，他的论文发表在《Microbiology》杂志上，论文描述了CRISPR染色体之外的来源。在Mojica的论文发表后一个月，Bolotin的论文才被接收。值得注意的是，Bolotin是第一个提出CRISPR如何提供免疫功能这一设想的研究人员，他推测，来自CRISPR基因位点上的转录物是通过反义RNA抑制噬菌体基因的表达来发挥作用的。尽管这一假设听上去很合理，但是很快就被证实是错误的。

科学发现的三大规律为：公关型、挑战型和机缘型。CRISPR的发现属于机缘巧合，但三位研究者都有备而来。虽然研究结果的发表之路艰难曲折，但是研究人员的坚持不懈最终使得研究结果公之于众。CRISPR的发现只是科研之路的第一步，它的验证及应用才是科研发现的最大价值。

（作者：马驰）

参考文献：Cell 2016;164:18-28