1953年1月18日，英国年轻的物理学家克里克(Francis Crick)和美国年轻的生化学家沃森(James Watson)合作在英国剑桥卡文迪什研究所揭示出核酸（基因）的化学结构。他们提出了脱氧核糖核酸（DNA）分子结构的双螺旋模型即著名的 “沃森-克里克模型”，轰动一时。这一成就后来被誉为“二十世纪生物学最伟大的发现”和“生物学中的决定性突破”。此项研究为他们赢得了1962年的诺贝尔生理学或医学奖。DNA分子双螺旋结构学说的提出使得分子生物学以及重组DNA技术迅猛发展。时至今日，分子生物学已成为生命科学基础研究领域中的带头学科。在众多分子技术中最为典型的例子是聚合式酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，被视为分子生物学诞生的标志，为今天生物工程学的蓬勃发展开辟了道路。

PCR的大胆设想

    PCR是一个类似于DNA天然复制的过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。上世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想:“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆基因。”

PCR的实现与诺贝尔奖得主——Mullis

    1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适的条件——模板DNA、寡核苷酸引物、DNA聚合酶和合适的缓冲体系。

    Mullis出生在美国北卡罗来纳州Blue Ridge山脚下的小村庄，那是一个充满大自然情趣的林区。Mullis从小就对科学表现出浓厚的兴趣，思维非常活跃。童年时代他曾经设计过一个火箭和一个改良的炸药，将一只青蛙送上了高空。Mullis强烈的好奇心和广泛的兴趣为他在DNA研究上的建树奠定了基础。Mullis起初是想在寡核苷酸上做些简单的研究，希望找到新的研究方向，以便看看能用DNA做些什么。

    1983年4月，在开车去度周末的路上，Mullis考虑是否可以有一种方法对微量生物样品中的DNA结构进行鉴定，因为很多致病基因的鉴定都只能在很少的样品中进行。最初他想利用Sanger做DNA序列分析的原理，但是做序列分析时，引物的结合并不能保持足够的特异性。于是，他想到在目的基因的下游再加一条引物，这条引物结合在互补链上，两次序列分析的结果可以互补而确认。然而DNA样品中含有的脱氧核苷酸可能会干扰双脱氧核苷酸的参入。解决的办法是将实验分两步进行，第一步先在反应体系中加入脱氧核苷酸，反应完成后可以获得不同长度的DNA片段；然后加热使各种不同长度的两条链解链，再加入新的寡核苷酸引物和同位素标记的双脱氧核苷酸得到标记片段进行分析。不过，如果脱氧核苷酸的量已经足以合成新链全长，就无法进行上述分析。想到这里，Mullis突然意识到，尽管这样合成的DNA链不能用于分析DNA的序列，但是如果反复进行这一反应，无疑位于两个引物之间的序列会得到扩增，扩增出来的DNA应该是位于两条引物间特异性序列。Mullis认为这个想法相当简单，不可能是创新性的。回到公司，他向同事们询问，却没有人听说过类似的方法。Mullis用了数月时间进行了准备，结果实验一举成功。该方法首次发表在1985年的《Science》上，用于镰刀状贫血的基因诊断并获得了良好效果。Mullis的PCR实验最初并没有造成轰动。因为有很多因素，如引物的非特异性结合、DNA延长的意外终止以及核苷酸参入错误等足以使得这一反应难以具备实用价值。但Mullis并没有因此而放弃，通过一个一个奇怪的想法，通过不断的试验终于发明了PCR 。由于Mullis 在PCR上的卓越贡献，他获得了1993年诺贝尔化学奖。

DNA聚合酶的改善和PCR仪器的产生

    说起PCR就不得不提到DNA聚合酶，这是PCR反应中的关键因素。Mullis最初使用的 DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片段，其缺点是不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新添加。引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致酶失活，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序带来了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。为了克服这些缺点，1988年初Keohanog等使用了T4 DNA聚合酶。T4 DNA聚合酶特异性比Klenow高，扩增的DNA片段均一，真实性好，但仍具有热不稳定性。1988年Saiki等使用了Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶能耐95℃高温而不失活，这使PCR过程中不必反复加入新酶，便于自动化。Taq DNA聚合酶是从一种水生栖热(Thermus aquaticus)yT1株分离提取的。yT是一种嗜热真菌，能在70℃～75℃生长，该菌是1969年从美国黄石国家森林公园火山温泉中分离的。Taq DNA聚合酶的最适反应温度是70℃～75℃，故反应特异性高。由此可知，Taq DNA聚合酶的开发与利用完善了PCR技术，排除了PCR自动化的障碍。到1988年美国PE公司与Cetus公司合作共同研制了PCR自动扩增仪。

PCR的医学应用

    PCR反应理论的提出和技术上的完善对于分子生物学的发展具有不可估量的价值，它以敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便等不可替代的优点迅速成为分子生物学研究中应用最为广泛的方法，使得很多以往无法解决的分子生物学研究难题得以攻克。

    PCR技术已在生命学、医学诊断、遗传工程、法医学和考古学等领域广泛应用，在临床检验中的应用，对疾病的诊断提高到基因水平，众多的疑难病症得到及时确诊和有效的治疗。目前PCR技术的医学应用包括以下几个方面。

1.疾病的诊断

    在PCR的众多应用当中，最重要的就是对疾病的诊断。传统医学对疾病的诊断往往根据临床症状和体征，实验室检查和病原体培养费时、费力、准确度差，操作性差。PCR的出现对于疾病的诊断，尤其病原体的诊断起到了重要作用。以乙肝病毒为例，PCR可直接检测HBV DNA，提供HBV有无复制和传染性的可靠证据。而且PCR技术还可以用于乙肝病毒的分型，有研究表明，不同分型的乙肝病毒对不同的药物有不同的敏感性。通过PCR技术对乙肝病毒分型可以指导临床医生用药，还可以根据不同分型的病毒进行流行病学研究。性接触传染病是当今世界上广泛流行的传染病。淋病的诊断主要靠实验室检查，传统的涂片镜检误检、漏检率高；培养法条件苛刻，且培养时间长；免疫法存在交叉反应，且价格贵。PCR技术为这一难题开辟了新途径，是淋病快速、准确诊断的新突破。PCR对某些肿瘤的诊断已成为简单而又灵敏的方法，并可作为肿瘤治疗的监测手段，为肿瘤的诊断、疗效观察、预后判断提供了快速、准确的新方法。近年来研究发现幽门螺杆菌是胃炎和消化性溃疡的重要致病因子，常规检查特异性差，PCR 技术则是一种快速、准确、敏感的方法，有利于早期诊断，及时治疗。

2.优生优育

    孕期如受到弓形虫、风疹病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒感染，都可能致胎儿流产、早产、死亡或畸形。近年来世界先进国家都已将这组病毒检查列为孕期常规筛选项目。PCR是目前优生优育实验诊断中灵敏度最高、特异性最强的新技术。PCR检查对保证优生优育、提高人口素质，具有十分重要的意义。

3.法医学的发展

    虽然现在处于和平年代，各种犯罪率有所下降，但不能完全杜绝犯罪的发生。在没有新技术出现之前，警方取证存在一定困难。PCR技术的出现，强有力地推动了法医物证学的发展，使法医物证检验得到科学的保证，可以直接检测基因用于亲子鉴定，为处理财产继承，非婚生育，通奸、强奸致孕，寻找失散孩子等民事纠纷及刑事案件提供了可靠的科学依据．

4.实时荧光定量PCR的出现与应用

    PCR技术发明至今已近2O年了，在这期间得到了不断的发展，近年来出现的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术实现了PCR从定性到定量的飞跃，它特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应。目前实时荧光定量PCR成为了分子生物学研究中的重要工具并应用于临床医学。   

    实时荧光定量PCR的应用范围很广泛，包括mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性的测定等，应用最多的就是在肿瘤领域，从诊断到治疗，到耐药性的分析，每一项研究的突破都依赖实时荧光定量PCR。通过对肿瘤融合基因的定量测定能对肿瘤进行诊断，并实行个体化的治疗。虽然在过去的几十年里治疗方案的改进已大大地延长了白血病患者的生存期，但是缓解期的患者仍存在复发的危险性。因此微小残留病变的检测对于进一步调整治疗方案是至关重要的。通过PCR扩增急髓性白血病融合基因和急性淋巴细胞白血病基因重排，辅以Delphi程序设计信息系统就应用PCR技术能有效进行白血病分型及微小残留病变监控。PCR技术的应用和信息系统的建立方便了检测信息的管理及查询。实时荧光定量PCR的应用正成为检测肿瘤微小残留分子标志的一种必备的研究工具。随着大量化疗药物的应用，肿瘤耐药性问题凸显。耐药性限制了许多肿瘤的成功治疗，因此研究肿瘤细胞的耐药机制就变得十分重要。通过实时荧光定量PCR了解肿瘤耐药，指导临床治疗策略，通过观测用药前后及复发时肿瘤细胞的耐药基因mRNA表达变化，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。

    近年来，药物有效性和基因突变的关系是研究热点。通过PCR技术的支持就可以明确疾病相关的突变与药物治疗有效性的关系。比如急性心肌梗塞预后患者和置入支架患者常口服氯吡格雷（抗凝药）和小剂量阿司匹林预防血小板沉积。常见的细胞色素P450 2C19第681位基因变异G＞A（*2）导致不同个体服用氯吡格雷预防效果存在很大差异。巴黎大学的研究者进行了一项队列研究，主要评估CYP2C19*2基因多态性是否影响长期服用氯吡格雷患者的远期疗效。这项研究主要以PCR为技术手段进行结果分析。PCR的产生对于分析药物有效性和疾病相关基因变异起到了重要的作用。

    实时荧光定量PCR技术检测细胞因子是另一项重要的应用。细胞因子是调节蛋白，它在免疫系统中起着核心作用。细胞因子可被分为白介素、干扰素、集落刺激因子、肿瘤坏死因子、肿瘤生长因子和化学因子。为了阐明在许多炎症反应、自身免疫性疾病和器官移植排异中的免疫致病途径，细胞因子mRNA表达谱的可靠定量是很重要的。尽管被检样本中细胞因子含量往往极低，然实时荧光定量PCR以其高敏感性和准确性在细胞因子的定量中越来越受到青睐。

（作者：马驰）