同义突变

    疾病的发生包括多种发病机制，基因突变是其中的一种。基因突变是指基因组DNA分子发生的突然的可遗传的变异。从分子水平上看，基因突变是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。按照基因突变对机体产生的影响分为同义突变、错义突变、无义突变等。同义突变就是碱基置换后，虽然密码子变成了另一个密码子，但由于密码子的简并性，改变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。科学家已经对不改变氨基酸序列的基因突变会不会影响人类健康这个问题争论了很久。最近研究表明同义突变能以多种方式触发疾病的发生，沉默基因不再沉默。

    对沉默基因的探讨归根结底开始于蛋白表达的问题。美国国立癌症研究中心的Michael Gottesman和他的同事当时正在进行细胞膜蛋白、p-糖蛋白和药物代谢相互作用的研究。有研究发现在癌症治疗期间有些患者出现化学疗法的抵抗，p-糖蛋白就是产生耐药性的原因之一。p-糖蛋白是肿瘤细胞多药耐药性基因MDR1编码的一种跨膜糖蛋白，是一种与被转运物结合的载体蛋白，可通过一系列构象变化而实现跨膜转运。高表达此类蛋白的肿瘤细胞能将进入胞内的化疗药物泵出胞外，从而产生耐药性。当科学家在细菌细胞内大量表达这种p-糖蛋白时，无意中发现了一个问题。由于64种密码子编码20种氨基酸，这就意味着一种氨基酸对应多种密码子，不同的机体会优先选择某些能更快翻译的密码子。

    编码p-糖蛋白的多药抗药性基因（MDR1）大约存在50多种单核苷酸多态性，其中一部分位于编码区，但并不会影响蛋白氨基酸的序列。例如，外显子26密码子ATC突变为ATT，但编码的是同一种氨基酸——异亮氨酸。科学家常规假设这种 “沉默”或者“同义”突变并不会影响蛋白功能，但是临床数据清楚地表明携带这些突变的人群对药物的代谢是不同的。研究人员正在探索这些同义突变是如何产生上述影响的。Gottesman认为同义突变可能干涉了蛋白质翻译的节奏，改变了蛋白质的产生。随后研究人员表达了ATT密码子和其相应的另两种自发的突变多态密码子，结果发现这些密码子的mRNA的表达水平以及蛋白质的表达是相同的，但蛋白质的活性却发生了改变。正如Gottesman所假设的，由于翻译的时间被改变了，导致所生成的p-糖蛋白也发生了变化。这项研究结果发表在2006年《Science》杂志上，但这不是唯一关于同义突变的报道。同一期《Science》中的另一篇文章指出，编码控制痛觉的邻苯二酚-O-甲基转移酶的密码子发生了同义突变，这影响了相应的mRNA结构，从而影响了蛋白质的表达水平。这两篇文章都是第一次指出基因发生自发同义突变后所产生的蛋白质虽然氨基酸顺序没有变化，但是对疾病明显存在不同的功能影响。在这之后5年，人们开始关注同义突变所产生的深远影响。

    研究发现至少超过50种疾病与同义突变相关，如抑郁症、精神分裂症、多发细胞癌、囊性纤维化和克罗恩病等。尽管基因组相关性研究已经常规排除了同义多态性，但研究人员承认对同义突变需要进行进一步的研究。例如在最近一项超过2000项人类基因组研究的检查中，斯坦福大学医学院的团队发现同义突变也像非同义突变一样在疾病的发生、发展中扮演重要角色。美国FDA血液实验室的Zuben Sauna对此感叹道：“5年前，我们完全忽略了沉默基因。而现在，越来越多的科学文献指出我们应该开始重视沉默基因在疾病和生物制剂研发方面的作用。”

    目前，通过操控同义密码子来生产治疗性抗体、疫苗和进行基因治疗已经变成常规的生物技术。据估计，有时候，治疗性蛋白质有差不多80%的部分是由自身的天然形式变化而来的。如果同义突变确实能影响蛋白质的构象和功能，那么生物公司应该更好地对同义突变进行研究以确保他们在使用正确的蛋白质原型。

#p#副标题#e#

致病机理

    在DNA测序技术被研发之后不久，即40多年前，人们就意识到密码子的产生几率其实不是均等的。进化遗传学家指出，从病毒和果蝇到兔子和人类，不同物种都存在某些氨基酸会倾向于通过某些特定的密码子进行编码，尤其是那些高表达的基因。同其他基因相比，这些部位发生基因突变的数量较少。不知何故，那些高频率的密码子似乎对高表达的蛋白质十分重要，可能促使表达过程更快速更准确。芝加哥大学的细胞进化生物学家Allan Drummond说道:“这似乎是进化过程在说‘不要扰乱这些基因位点；它们已经被最优化了’。”

    科学家都在怀疑这个所谓的“密码子偏倚”在哺乳动物中是否真的重要。许多人认为自然界维持偏倚的进化压力会比人们所预计的弱。但在2005年，英国Bath大学的Laurence Hurst和他的同事们发现小鼠、黑猩猩和人类基因组同义位置的选择性标记，特别是在外显子拼接点。总的来说，Hurst估计哺乳动物中大约有10％的同义突变存在优势可以使它们应付强大的选择压力。

    选择性标记出现在这些部位的事实表明：剪接的改变可能是同义突变触发疾病的主要作用机制。事实上，在大多数疾病相关性研究中，拼接位点的干扰是导致疾病的罪魁祸首。当然，这也可能是由于这是最易被发觉的发病机制。

    在今年早些时候，法国尼斯大学的Patrick Brest研究团队报道发现一个GTP酶家族M（IRGM）基因编码区域的同义突变正巧位于miRNA分子的结合位点。IRGM具有清除胞内细菌的功效。而这个同义突变由CTG转换为TTG，正是与克罗恩病相关的基因多态之一。当人体肠道发生感染时，肠道上皮细胞里会大量表达一组miRNA分子。这些miRNA分子与免疫相关IRGM基因编码的miRNA分子相结合，结合部位刚好就是C/T突变位点所在的部分。该部位的核苷酸序列CTG/TTG均编码亮氨酸。如果IRGM基因是CTG型序列，那么就能够与miRNA分子完全匹配，下调IRGM蛋白的表达，从而精确地清除胞内存在的细菌。如果IRGM基因是TTG型序列，那么这种调控机制就会受到影响，无法正常发挥作用。

    研究人员设计合成了一种能够与TTG序列完全匹配的miRNA分子，结果证实C/T位点对于克罗恩病的发生至关重要。在TTG型基因患者体内，miRNA介导的调控机制完全失效，IRGM蛋白的表达水平非常高，所以细菌清除途径完全失控。研究人员进一步证实在克罗恩病患者肠道组织内总是能够发现高水平的miRNA表达情况，这说明机体一直在试图通过miRNA调控途径来清除细菌，但是因为存在TTG突变，所以无论表达多少miRNA也都是徒劳的。这种同义突变致病的情况可能发生在任何疾病中。因此，弄清楚同义突变如何影响人体，能够在多大程度上对人体造成影响，这一点非常重要。

    另一个同义突变致病的例子是由美国阿拉巴马大学伯明翰分校的研究小组报道的。他们在最常见的囊泡性纤维症中发现了一个同义密码子突变，导致了mRNA的错误折叠。研究发现，密码子的突变可能干扰RNA进入核糖体时的停顿节奏，从而改变氨基酸链的折叠。而这可能就是同义突变的关键致病机制，而且其多样性可能远远超过人们所预计的。

    长久以来，人们对于同义突变的研究仅限于观察型。随着技术的发展，研究人员可以对不同的同义突变开展大规模的系统性研究。最近，宾夕法尼亚州大学的一个研究小组建立了编码绿色荧光蛋白的154种不同的变异基因，每一种都在不同的位点发生了同义突变。他们在埃希氏菌种中表达这些基因，结果发现荧光蛋白的表达水平范围扩增了250倍，这似乎不是由密码子偏倚而是由mRNA的二级结构改变造成的。其中深层的机制尚待进一步的研究确定。

#p#副标题#e#

沉默基因的深远影响

    在研究人员深切了解到沉默基因之前的很长时间，转换同义密码子成为在工业上的标准操作规范。1977年，参与建立世界第一个生物技术公司——基因泰克公司的生物化学家Herbert Boyer，首次用噬菌体合成编码激素-促生长素抑制素的人类基因。Boyer了解蛋白氨基酸序列，但是并不知道基因核苷酸序列，所以他和研究团队连接了E.coli最优选择的密码子，因为他们打算在这种生物体中表达促生长素抑制素。尽管南旧金山生物技术从来没有将蛋白质发展成商业产品，这种密码子最佳化的生长抑素基因是生物技术的发展基石。

    由于研究人员在不同的细胞宿主中能将表达基因做得更好，基因合成的费用也在降低，最大程度优化密码子从而提高表达水平成为了行业准则。然而表达最优蛋白质的基础技术同基因泰克早期相比仍旧没有改变：通过重新编码DNA使宿主体内高表达的基因能优先使用最佳的密码子进行翻译。但据一项研究统计，傲锐基因技术公司多达70%的客户希望能按他们自己的途径将生物产品的编码基因最优化。然而，其结果却非常不理想。追根究底，失败的关键因素在于大多数人忽视了基因组中的沉默位点，缺乏一套能够准确预测表达结果的方法。目前，这种情况有所改善。例如，研究人员可以利用转运RNA而非密码子来预测氨基酸的翻译情况。

    除了优化密码子以外，对治疗性蛋白质的密码子进行处理有可能对人类的健康产生不可预知的影响。从目前的试验技术来看，研究人员不相信人们可以任意制造出各种蛋白质且保证这些蛋白质的功效与其自然状态下的完全一致。被人为改变的蛋白质可能发生变化，导致产生免疫原性。而这种免疫原性只有在最终的临床试验阶段甚至在获批上市后才会被发现。迄今已经出现太多这方面的例子：治疗性蛋白质生产过程中的一个微小变化就会极大影响产品的药效和安全性。毫不意外，同义突变也可能造成同样的危害。所以生产治疗性蛋白的公司需要找到更好的方法生产更安全的生物药物。当医药公司在生产产品的时候，必须严格核实科研人员所设计的DNA序列能够准确编码出他们所需要的蛋白质制品，但他们却不会去注意这种被改造过的基因序列究竟与其自然状态有多少差异性。其实明确蛋白质的原始DNA编码序列是非常必要的，这有助于研究人员优化密码子并提高生物医药制品的安全性。

（作者：马驰 审校：沈颖）

参考文献：《Nature Medicine》2012;17:1536-1538