2013年初，用谷歌搜索“CRISPR”会出现很多的结果，至今仍旧保持这一趋势。研究人员已经报道了在多种生物内使用基于CRISPR的基因组编辑技术，包括酵母、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和猴子。研究人员更感兴趣的是在人类医疗和农业生产的潜在应用的科学和商业价值，同时这个技术可能被用来培育设计婴儿的前景也引发了社会关注。

以遗传性疾病为例，最近该技术已经用于杜氏肌营养不良（Duchenne’s muscular dystrophy，DMD）的小鼠模型。三组研究人员近期已经描述了CRISPR-Cas9技术用于移除编码DMD蛋白的基因突变，由此影响该蛋白的表达、治疗DMD。

研究人员利用CRISPR-Cas9基因编辑系统，剪切了小鼠模型的DMD突变部分，从而可以允许肌纤维中的抗萎缩蛋白的较短部分得到合成，恢复了部分肌肉功能。这种方法可以移除大概80%DMD患者的基因突变。

研究人员利用基因治疗载体——腺相关病毒载体（adeno-associated virus，AAV）传递必需的CRISPR-Cas9成分到肌肉中，对小鼠的肌肉来说这是一种有效的基因传递载体，但是这种载体限制携带DNA的容量，比如DNA的长度要小于4.7kb。编码Cas9核酸内切酶的基因被包裹在一个AAV载体中；Cas9蛋白，一种核酸内切酶，剪切DNA。引导RNA（guide RNA，gRNA）序列被包裹在一个不同的AAV颗粒中，该gRNA能指导CRISPR-Cas9蛋白到特定的DNA序列。一旦gRNA连接到它的同源DNA序列，Cas9核酸内切酶就会顺着DNA进行切除。

AAV载体被传递进入杜氏肌营养不良模型鼠mdx中，该小鼠模型在 Dmd基因的第 23外显子位置携带无义突变。该变异导致Dmd 信使RNA(messenger RNA，mRNA)翻译成蛋白的过程过早的终止，由此终结了抗肌萎缩蛋白的产生。在 CRISPR-Cas9 基因校正策略中，gRNAs引导Cas9蛋白切割两个非编码内含子，它们位于外显子23的两边。切割的末端被细胞的内源性非同源末端连接功能重新连接上，允许Dmd基因 mRNA的阅读框保持完整。尽管没有被切除外显子编码的氨基酸，但是依旧可以生成抗肌萎缩蛋白。

基因校正的初始有效率预估约为2％。但抗肌萎缩蛋白的水平一直在增加，也许是因为不断的校正，从肌纤维的AAV构建，这个过程可以持续数月。一组研究人员提出的证据表明，基因校正也发生在卫星细胞、肌肉的干细胞。采用AAV或电穿孔法（electroporation）引导 CRISPR-Cas9 和 gRNAs（设计为切除DMD的21和23外显子）至 mdx 小鼠肌肉中的类似研究也提供了证据，证明肌肉功能获得了改善。但是，这些基因传递的方法很难转化到临床，进行实际应用。

CRISPR-Cas9方法同其他正在发展的方法相比究竟如何呢？通过对基因组进行改变，可以获得对肌细胞的永久性修复。与目前正在进行临床试验评估的“外显子跳跃”寡核苷酸的药物相比较：这些寡核苷酸被强制进行选择性剪接，DMD外显子含有的突变拼接出mRNA ，导致截短的抗肌萎缩蛋白合成。但是因为外显子跳跃的试验药物没有改变根本的DMD序列，所以不得不频繁重复给药。另一种方法是AAV基因治疗方法：它涉及用截短的“微缩”版DMD。较短的DNA序列装配到AAV载体中，被认为在小鼠上是有效的，虽然合成全链蛋白更为理想。这种策略不需要控制宿主细胞基因组，每一个接受AAV-微抗肌萎缩蛋白载体的肌细胞都会产生治疗性蛋白；此外，该策略是通性的，并不需要对每个患者进行量身定制。然而，通过AAV载体实现的表达预期是不会长久的，所以抗肌萎缩蛋白的产生可能不会像在CRISPR校正肌细胞中那样长时间存在。另外，“微缩”DMD编码抗肌萎缩蛋白比由CRISPR-Cas9修饰的 DMD 要小，所以在功能上有所打折。

阻碍 CRISPR-Cas9技术应用的因素包括有效率相对低下。Dmd 表达仅在一部分经过治疗的细胞中才有。尽管CRISPR-Cas9 系统的精确度不断在改善，但是对于那些不希望被切割的基因组位置仍然存在脱靶的风险。因此，在证明 CRISPR 系统能足够安全地进行临床试验之前，还需要进行更多的研究工作。同时也存在一个普遍的问题，就是如何能将CRISPR-Cas9有效传递至DMD患者大量受累的肌肉中。在小鼠模型试验中AAV 载体的表现非常好，但是是否在人体组织中也能进行准确无误的传递还是一个未知数。而且载体需求量很大，生产如此大量的载体很困难，且费用高昂。此外，人体对AAV衣壳、Cas9蛋白和抗肌萎缩蛋白的免疫反应就是一个潜在的障碍。对于这些问题都可以找到解决方法，正如存在可以避免这些问题的方法一样。能治疗如 DMD 这类疾病的方法将会越来越多，终会有一种方法获得成功。

对于很多遗传性疾病而言，CRISPR技术就是未来的曙光和希望。不论未来的路有多艰难，研究人员都会一如既往地前行。每一项技术应用到临床都需要经过重重验证。为了造福人类，CRISPR技术英雄榜上的每一个研究人员都付出了努力和汗水，相信在不久的将来CRISPR英雄将看到该技术成功应用于临床的一天。

CRISPR的启迪

CRISPR的早期开拓者在研究道路上继续前行，但是开拓者已经不再孤单，全世界有更多的研究人员进入这一领域，成为新的CRISPR英雄，他们进一步地阐明CRISPR的生物学，改善和扩展基因组编辑技术，并且用于解决更多的生物学问题。20年前在西班牙盐沼泽发现的曾经不为人知的微生物学系统如今却成了各大科学期刊、纽约时代杂志的头条、学术会议的焦点。CRISPR的时代已经来临。

CRISPR的故事引起了研究人员对人类生态系统的思考，人类生态系统可以促进科学进步，而这些进步与基金组织、普通公众和充满热情的研究人员密不可分。

最重要的一点就是医学突破经常出现在意想不到的地方。CRISPR早期英雄们的研究方向都不是研究编辑人类基因组，甚至都不是研究人类疾病。他们的研究初衷混合了个人兴趣（为了弄清楚耐盐细菌奇怪的重复序列）、军事上的迫切需求（为了防范生物战争）和在工业上的应用（为了提高酸奶产量）。

这段历史也说明了基于大数据的“无假设”发现在生物学中越来越重要。CRISPR基因位点、生物学功能和tracrRNA的发现都不是来自实验台上的实验，而是来自大范围、公开的基因数据库的生物信息学的开放式探索。“假设驱动”科学依然是基本的研究过程，但是21世纪将会看到更多将两种研究方法相结合而发现的新事物。

许多CRISPR英雄们在他们30岁之前科学生涯的起点就开始了他们的重要工作，比如Mojica，Marraffini，Charpentier，Vogel等。因为年轻喜欢冒险，经常在无人涉足的方向和看似无人问津的问题上冒险，并且渴望获得成功，成为他们的动力。对于如今这个首次获得NIH资助的平均年龄已经升到42岁的时代而言，这是一个重要的提醒。

还需要注意一点，很多人取得标志性的工作结果并不是在常规的科学研究地点，而是在一些非科学研究地方，如西班牙的阿利坎特；法国的国防部；丹尼斯科的公司实验室。而且，他们的重要论文都被一流杂志拒绝过，在延迟很久之后才得以发表，并且不受关注。这些遭遇并非巧合：这些研究地点可能给了非热门研究更大自由，但是对于如何克服期刊和评审人的怀疑，这方面的支持却是很少的。

这段发展史充满了传奇色彩，只要你有一双善于发现的眼睛，哪怕提出的问题无法获得确切的答案，但只要结果真实存在，经过不懈的努力，总会获得成功。对于普通公众和充满热忱的年轻研究人员，这是精彩的一课，也给未来的研究人员带来深刻启迪。

（作者：马驰）

参考文献：New England Journal of Medicine 2016;374:1684-1686