在医学和生物科学领域中，新的简单易用的细胞基因组编辑工具所带来的影响不论怎样形容都是不过分的。这种近年来受到高度重视的新方法是来自于细菌免疫系统的DNA剪切工具——规律成簇的间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）-Cas9技术，其几乎可以应用于所有种类的细胞中。通过使用CRISPR向导（例如CRISPR RNA可以引导Cas9定位于人类基因组中的特定位置），Cas9酶可以靶向作用于培养的细胞或实验室动物的特定基因，发挥沉默或编辑作用。也许有一天，当技术和道德方面的限制被解决之后，这种方法可以真正被用于治疗人类疾病。

    CRISPR是存在于细菌中的包含早期入侵的病毒序列的DNA片段。这种DNA片段可被细菌用于检测并清除之后入侵的类似病毒DNA。这些序列在细菌免疫防御体系中具有重要作用。

    首次对CRISPR的描述发生于1987年，日本大阪大学的Yoshizumi Ishino和Aniket Walia意外地克隆了一部分CRISPR，当时研究者并不清楚该重复序列的功能。1993年，研究结核杆菌的荷兰学者发现，不同菌株的结核分枝杆菌具有的这类序列并不相同。同时，西班牙学者Francisco Mojica开始对其功能进行研究，但是他最初的假设并不正确：其认为这些片段在细胞分裂过程中发挥作用。2001年，Francisco Mojica和Ruud Jansen首次将重复序列命名为CRISPR，以避免文献描述该序列的混乱。

    2005年，三个独立的研究小组发现，一些CRISPR间隔区（spacers）DNA来源于噬菌体DNA和染色体外DNA（如质粒）。实际上，这些间隔区是从以前试图攻击细胞的病毒中收集而来的DNA片段。间隔区的来源提示，CRISPR-Cas系统可能在细菌的适应性免疫中发挥作用。Francisco Mojica研究小组首次预测到CRISPR的真正功能。2007年，第一项证实CRISPR在细菌适应性免疫中发挥作用的实验研究发表。2013年，中国学者张峰研究小组和George Church研究小组的关于CRISPR-Cas9应用于人类细胞基因编辑的论文，发表于同期的《科学》杂志上。

    CRISPR具有如此高的效率，以至于在技术上有望同时检测每一个人类基因的生物学功能。 Park等学者在人类免疫缺陷病毒1型（human immunodeficiency virus type 1，HIV-1）的背景下也确实这么做了。Park等人应用了通常对HIV-1易感的T细胞系，利用基因工程技术使其表达Cas9，并引入了数千种CRISPR向导RNA。每种CRISPR向导RNA均能够导致特定人类基因的敲除。研究人员用HIV-1病毒感染这些包含CRISPR-Cas9的细胞群，随后选择抗HIV-1感染的细胞，并确定哪些CRISPR向导（或哪些基因敲除）导致了细胞可以抗HIV-1感染。

    结果发现，在敲除五个基因后，细胞对HIV-1具有强大的抵抗能力。其中四个靶向敲除基因直接或间接参与病毒进入细胞过程：其中两个基因（CD4和CCR5）编码已知的HIV-1受体-共受体（coreceptor）对结构，另两个基因TPST2和SLC35B2分别编码硫酸化酶和硫酸盐供体转运子。这些发现是有意义的，考虑到CCR5的硫酸化有助于HIV病毒进入细胞。第五个基因ALCAM编码一种细胞粘附分子，其可以促进所培养的细胞聚集在一起；通过促进病毒粒子从受感染的细胞转移到未感染的邻近细胞，加速了病毒复制。由于ALCAM在原代T细胞中仅仅低水平表达，其在体内可能并不具有重要意义，但是Park等人的体外研究表明，其他细胞粘附分子对于HIV-1在原代细胞中的传播也是重要的，并且可能在体内也具有同样作用。

    令人惊奇的是，使用CRISPR方法发现，只有非常少的基因涉及HIV-1病毒感染。然而，使用经典的基因功能检测技术——RNA干扰的研究结果表明，多达数百个宿主基因对HIV-1感染具有重要意义。造成这种差异的原因有以下几种：首先是Park等人所使用的筛选设计，能够鉴定HIV-1复制的早期步骤中涉及的重要基因，而不是在后期更复杂和宿主依赖步骤中的基因；此外，与RNA干扰的作用仅仅是瞬时作用不同，CRISPR敲除必须与更长期的细胞活力维持共存。正如Park等所指出的一样，以RNA干扰技术所筛选鉴定的HIV-1复制所需的基因，很少经过后续研究确认其对于HIV基因复制具有重要意义。许多通过瞬时RNA干扰所鉴定的基因，可能仅仅是通过干扰细胞生理从而间接作用于HIV-1复制过程，当通过CRISPR技术敲除这些基因并不会严重影响细胞活性。实际上，CRISPR和RNA干扰技术都不能鉴定出许多已被确定在病毒复制过程中具有重要作用的基因，这可能是因为大多数被HIV-1利用的基因也对细胞存活同样具有重要意义。

    如果研究目标是获得完整的HIV-1复制的分子机制，那么这种CRISPR筛选方法的弱点是不能识别必需的宿主基因产物。另一方面，如果研究目标是鉴定可以用作药物靶标的宿主蛋白质，那么通过基于CRISPR技术所发现的非必要的基因，将具有不可比拟的优势。

    如何才能使Park等人的研究结果用于促进HIV病毒感染的治疗？事实上，相关应用已经在临床阶段得到证实。马拉韦罗（Maraviroc）是一种可以结合CCR-5的小分子药物，是一种有效的临床批准的HIV感染抑制剂。事实上，马拉韦罗是目前唯一被批准的靶向作用于宿主（而非病毒）蛋白的HIV-1抑制剂。此外，一种可与可溶性CD4免疫粘附素结合的硫酸化N-末端CCR-5衍生肽，目前已作为HIV预防药物被研究。Park等研究中所鉴定出的基因已被充分利用这一事实，显示了快速鉴定最有希望的宿主基因产物（作为靶标）的CRISPR方法的强大。

（作者：赵永刚)

参考文献：New England Journal of Medicine 2017;376:1290-1291