医学前沿
2017年08月号
医学进展

癌症中的泛素-蛋白酶体系统和降解决定子

作者:包丽霞

癌症被视为一种蛋白异常降解的疾病
癌症被认为由基因突变引起。超过半数的癌症会发生TP53基因点突变,而所编码的蛋白p53(TP53)作为基因组保卫者的功能也受到损害。然而,癌症也可由基因异常表达引起。例如,基因重复、非整倍性和染色质状态重塑会导致癌基因表达更多促癌蛋白,或抑制肿瘤抑制基因的表达。基因突变和基因表达的改变常常密切相关。例如,一个基因突变会导致肿瘤抑制因子(负调节基因表达)的失活,进而导致癌基因表达的增加。因此,理解癌症的先决条件是对基因突变和基因表达改变均进行充分的理解。
本文聚焦于泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)和降解决定子(degrons)的重要作用,以及药物设计的应用和未来的发展前景。
泛素-蛋白酶体系统
泛素-蛋白酶体降解途径是如何工作的?
真核生物的细胞内蛋白降解主要是通过UPS来完成的。UPS系统在维持细胞稳态中发挥着必不可少的作用,该系统是通过参与控制蛋白质质量来发挥上述作用的。例如,该系统可识别并快速降解错误折叠或装配的蛋白质。除了清除异常蛋白,UPS系统还负责了参与细胞调控的动态蛋白质轮转(protein turnover)。这种时间上和空间上对蛋白降解的调节在多种细胞过程中起到关键作用,包括细胞周期进程、信号传导、分化和生长过程。
UPS系统拥有一个复杂的靶向降解蛋白的酶网络。该系统核心的工作机制是26S蛋白酶体,其由2个主要的结构成分组成:20S核心颗粒和19S调节颗粒。
泛素化机制
泛素与底物蛋白共价结合(泛素转移至底物),是通过3种酶来完成的。这些酶包括E1泛素活化酶、E2泛素结合酶和E3泛素连接酶。人类基因组有2个基因编码E1酶,41个基因编码E2酶,以及超过600个基因编码E3酶。据此,可看出E3酶变异在复杂的细胞内翻译后蛋白稳定性的时空调节层面的重要性。泛素在E1酶的作用下被活化,该过程依赖ATP。E2酶与底物特异性的E3酶之间的相互作用会形成异肽键,该异肽键位于泛素的C端的甘氨酸残基与底物蛋白的赖氨酸残基之间。所结合的泛素蛋白可被K48(泛素的7个赖氨酸残基K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63中的一种)泛素化来形成多聚泛素链结合到底物蛋白上,因此可靶向底物蛋白进行26S蛋白酶体介导的蛋白降解。
具有E3链接酶活性的蛋白质和蛋白复合物可以根据核心蛋白结构域(促进泛素转移至底物)分为两种主要的家族。第一种是包含HECT结构域的E3连接酶家族,第二种是包含RING结构域或其变异体的E3连接酶家族。HECT家族的E3酶是通过先将泛素转移至HECT结构域,再转移至底物蛋白上;RING家族的E3酶是直接将泛素转移至底物蛋白上。
泛素化后的其他结果
蛋白泛素化后的命运除了被26S蛋白酶体降解之外,还有其他结果。去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)可以将泛素从底物蛋白上移除,从而使蛋白的翻译后修饰过程可逆。即使没有DUB活性的存在,泛素信号的类型也可以影响泛素化蛋白的命运。底物蛋白可以被单个泛素所修饰(monoubiquitination;单泛素化),或多个位点只被单个泛素修饰(multimonoubiquitination;多单泛素化),又或被多聚泛素链所修饰(多聚泛素化)。多聚泛素链的形成是通过连续添加泛素至另一个泛素的7种赖氨酸残基之一,或至N端的蛋氨酸(M1)。根据每轮添加泛素至哪个残基,底物蛋白上的信号(“泛素编码”)可在细胞内被不同地解读。例如,K48和K11连接的多聚泛素链通常是一种蛋白酶体降解的信号;M1和K63连接的多聚泛素链或许介导了其他结果。单泛素化修饰靶向于浆膜的跨膜蛋白进行内源化和运输至溶酶体,而不同于K48多聚泛素化修饰将底物运输至26S蛋白酶体进行降解。单泛素化可能是分泌途径和内吞途径中细胞内蛋白运输的信号。此外,K63连接的多聚泛素化有助于DNA修复、蛋白翻译的调节以及细胞信号传导的调节。多聚泛素化链形成的其他位点也与非降解相关细胞过程相关,这些过程包括DNA修复(K6、K27和K33)、NF-κB信号转导(M1)和蛋白质的高尔基体后运输(K33)。
降解决定子的定义
细胞内蛋白丰度(abundance)的微调通常涉及E3连接酶,该酶可特异性地识别底物蛋白中的局部序列元件,该局部序列元件称为降解决定子。降解决定子的一个重要的特征是其可以转移,通过基因工程连接上这些降解决定子之后,生命周期长的蛋白变得不稳定。降解决定子通常是一种短的线性基序(motif),具有特异性的序列模式。对于相互作用非常关键的氨基酸残基表现出强烈的进化保守性。
降解决定子在药物设计中的应用
由于UPS可调节数种肿瘤相关蛋白的稳定性和功能,所以针对靶向UPS系统可开发治疗肿瘤的药物。蛋白酶体抑制剂——硼替佐米可能是第一个开发成功的靶向UPS系统的治疗多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的药物。蛋白酶体有3个主要的蛋白水解功能:胰蛋白酶样活性、糜蛋白酶样活性和肽基谷氨酰基肽裂解(酸化)活性。硼替佐米能够可逆性地结合到20S蛋白酶体的b5亚基,从而抑制糜蛋白样活性。令人惊奇的是,抑制蛋白酶体的活性可以选择性地对特定的骨髓瘤和淋巴细胞产生毒性。毒性的选择性很大程度是由于肿瘤细胞自身存在蛋白毒性压力,而这又是由肿瘤细胞本身高度的增殖性和快速的生长速率导致的。所以,许多服用硼替佐米的患者获得了良好的疗效,而且副反应具有剂量限制性或治疗限制性(药物的某些主要的毒副作用成为限制继续增大化疗药物剂量的主要原因)。抑制蛋白酶体针对的是蛋白降解机制中最为核心但特异性最差的靶标。这就是为何蛋白酶体抑制剂不适用于大多数的肿瘤,特别是实体瘤。
特异地抑制UPS系统的E1酶也是药物开发的一种策略。开发中的药物有PYR-41和PYZD-4409,它们是第一批开发的细胞可透过性化合物,目前处于临床前开发阶段。这类化合物可以抑制主要的人类泛素活化酶UBE1的催化活性。然而,与蛋白酶体抑制剂类似,该抑制剂也会对多种底物产生影响,从而限制他们的临床应用价值。类泛素化修饰(Neddylation)是一种与泛素化类似的过程,其中NEDD8活化酶(NEDD8-activating enzyme,NAE)发挥着与E1活化酶高度相同的作用。一种强效的选择性的NAE抑制剂——MLN4924是 Cullin-RING连接酶的间接抑制剂,可以阻止类泛素化从而抑制Cullin-RING连接酶的活性。MLN4924显示出了抗肿瘤活性,目前处于临床Ⅱ期研究阶段。
由于E3连接酶-底物这一复合物的丰度,以及其种类多、潜在选择性强,该复合物提供了UPS中大部分的靶点。然而,目前药物设计策略是靶向相对小而深的蛋白口袋,例如酶的活性位点,这种策略是被实践过可行的。相较而言,E3连接酶的作用主要是蛋白与蛋白之间相互作用,多年来被认为是不可成药的靶点。研究结果显示,蛋白间的相互作用可以成为有效的靶点,并且有望通过靶向作用于底物识别E3连接酶的活性来直接调节蛋白的丰度。
其中一个直接靶向作用于E3连接酶与底物相互作用的例子涉及MDM2(一种靶向p53的E3连接酶)和p53。通过高通量小分子筛选,发现nutlins这一类小分子可以模拟p53的肽基序来阻断MDM2结合位点。Nutlins可稳定p53,从而活化细胞周期停滞和凋亡途径。虽然nutlins不会进入结合口袋,但他们仍能有效地竞争性地抑制p53。这种竞争性的结合的出现是由于原本的降解决定子基序的相互作用涉及一个从无序到有序的转变过程,该过程需要大量的熵能,从而导致出现一个相对较弱的整体结合能力。上述概念被应用于设计钉肽,合成的α螺旋肽通过共价结合到原本的结合基序上。钉螺旋肽不仅保证了结构和生物活性的稳定性,还可用于优化先导化合物的药代动力学特征。此外,钉螺旋肽可以结合MDM4,相比当前使用的nutlins,可以治疗更广泛的癌症。靶向MDM2-p53结合界面(或通过其他方式干扰相互作用)的多种新种类的抑制剂目前正进行治疗多种实体瘤和血液肿瘤的临床研究。
靶向E3连接酶或底物的靶点很多,比如靶向cereblon(CRBN)蛋白的沙利度胺衍生物。CRBN有一个深的疏水口袋,可以结合沙利度胺、来那度胺、泊马度胺。除了硼替佐米和沙利度胺衍生物之外,还有靶向UPS的多种组成成分的小分子正处于临床前或临床研究阶段。最为特异性的抗癌作用被猜想来自于靶向那些具有最少底物的E3连接酶。然而,因为不同细胞类型的靶蛋白是不同的,所以E3连接酶-降解子抑制剂的效应在不同类型肿瘤中也是不同的。因此,E3连接酶调节剂——沙利度胺对多发性骨髓瘤很有效,但是对实体瘤无效。当选择新的药物靶点时,预测新靶点抑制剂的疗效是非常受限的。因此,生产出任何在细胞层面可实践的抑制剂都是有意义的,然后再将这种抑制剂在各种类型的细胞和疾病模型上进行测试。这些小分子抑制剂的另一个重要用途是作为实验研究中的试剂,甚至是那些发现是毒性过大的或不适合临床应用的小分子,仍可以作为研究用。鉴于上述考虑,所有E3连接酶-降解子相互作用的靶点都是有效的靶点。
目前已经鉴别出大约600种E3连接酶,但降解决定子基序仅确认25种。研究人员觉得需要花更多的精力来发现更多的降解决定子,并期望给生物医学研究带来益处,改善癌症治疗。
(作者:包丽霞)
参考文献:Science Signaling 2017;10:eaak9982

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