上次说到CRISPR技术榜上的三位英雄，今天我们继续完成以下旅程：了解CRISPR技术的功能与作用。

实验证明CRISPR能提供适应性免疫并能使用核酸酶

像Mojica一样，这几乎是Philippe Horvath选择的最有地方特色的论文题目了。作为一名斯特拉斯堡大学（University of Strasbourg）的博士生，他关注的研究对象是用来腌制泡菜的乳酸菌。鉴于他的兴趣爱好是食品科学，Horvath没有进行博士后研究，而是在2000年末加入了罗地亚（Rhodia）食品公司，一家位于法国西部当热圣罗曼（Dange-Saint-Romain）的细菌发酵培养公司，建立了第一个分子生物实验室。这家公司后来被丹麦公司丹尼斯科（Danisco）收购，而丹尼斯科公司则在2011年被杜邦公司（DuPont）收购。

罗地亚食品公司对Horvath的微生物学特长非常感兴趣，因为其它的乳酸菌，像嗜热链球菌（Streptococcus thermophiles）通常用于生产乳制品，比如酸奶和芝士。Horvath的任务就是开发以DNA为基础的方法，来精确识别菌株并且克服频繁的噬菌体感染，因为噬菌体感染是困扰乳制品发酵的一大难题。因此，理解特定嗜热链球菌菌株是如何保护自己防止被噬菌体攻击的作用机制既有科学意义，又有商业价值。

2002年下半年，在一次荷兰乳酸菌主题的会议上获知了CRISPR之后，Horvath便开始使用该技术鉴定菌株的基因型。截止到2004年下半年，他注意到间隔与噬菌体抵抗之间存在明确的相关性，在几个月之后Mojica和Vergnaud发表了相同的结果。2005年， Horvath和他的同事们，包括在丹尼斯科美国分公司任职的Rodolphe Barrangou和魁北克城（Quebec City）的拉瓦尔大学（Universite Laval）的杰出的噬菌体生物学家Sylvain Moineau，开始直接验证“CRISPR是一种适应性免疫系统”这一假说。Moineau也曾是一名产业科学家。他在拉瓦尔取得食品科学博士学位，主攻方向就是研究乳酸菌，在回到拉瓦尔工作之前在联合利华公司（Unilever Corporation）工作。自2000年以来，他一直同罗地亚食品公司合作。

利用一种对噬菌体敏感的嗜热链球菌菌株和两种细菌噬菌体，研究人员通过遗传选择来分离抵抗噬菌体的菌株。除了包含传统的抵抗性突变（如噬菌体侵入细胞所需的细胞表面受体上的突变），这种具有抵抗力的菌株在CRISPR基因位点上还获得了噬菌体来源的序列。而且，多重间隔的插入与抵抗力的增强相关，在这种作用下它们获得了免疫功能。

他们也研究了其中的两个cas基因的作用：即cas7和cas9。为了获得抵抗力，细菌需要cas7基因，但是这些携带噬菌体来源的间隔并不需要这个基因来保持抵抗力，这表明cas7参与产生新的间隔和重复，但并不参与免疫本身。相反，包含两种核酸酶模块（HNH和RuvC）的cas9基因对抵抗噬菌体是必不可少的。cas9蛋白是组成细菌免疫系统的活性组分。（提示：在早期的CRISPR文献中，现今著名的cas9基因被称作cas5或者csn1。）

最后，研究人员发现，能够克服基于CRISPR免疫功能的稀有噬菌体分离株在它们的基因里携带单一碱基变化，这种变化改变了与间隔相关的序列。因此，免疫功能的产生依赖于间隔与靶点之间的精准DNA序列的匹配。

为CRISPR编程

1989年，John van der Oost在阿姆斯特丹自由大学（Free University of Amsterdam）获得博士学位，他的理想是通过蓝藻细菌生产生物燃料，解决全球清洁能源的需求。在回到阿姆斯特丹之前，他在赫尔辛基和海德堡工作，研究细菌的代谢途径。1995年，瓦赫宁根大学（Wageningen University）为他提供了一个终身职位，但是有附加条件，即需要他来扩大一个团队，主攻极端条件生存的微生物。在德国期间，他就听说过嗜热链球菌，这种链球菌能够在美国黄石国家公园的温泉中繁殖，他希望能够对这些奇特的微生物在代谢途径上的进化差异进行研究。他开始跟微生物进化和计算机生物学领域的专家Eugene Koonin合作，Eugene Koonin在美国国立卫生研究院（National Institutes of Health，NIH）的国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）工作。Koonin已经开始对CRISPR系统进行分类和分析。在2005年的一次访问中，Eugene Koonin将van der Oost带入了这个鲜为人知的CRISPR领域。

Van der Oost已经从荷兰国家科学基金那里获得了主要资助。除了将这笔资助用于解决他计划书中描述的问题之外，他还将部分经费用于CRISPR研究。

Van der Oost和他的同事将一种大肠杆菌的CRISPR系统插入到另一种缺乏自身内源性系统的大肠杆菌中，使得这些大肠杆菌具有由5个cas蛋白组成的复合体，这一复合体被命名为Cascade。

通过分别敲除每个组分，Van der Oost等研究人员证明，在CRISPR基因位点转录的一个长前体RNA接入61个核苷酸长的CRISPR RNA（crRNAs）的过程中，Cascade是必需的。研究人员对crRNAs进行克隆和基因测序发现，crRNAs开始于8个碱基的重复序列，随后完全间隔，然后开始下一次的重复。这些发现支持了早期的假设，即这些重复序列的回文（palindromic）属性将导致crRNA中次级结构的形成。

为了证明crRNA序列是造成基于CRISPR抵抗的原因，研究人员着手创造第一个人工CRISPR序列，以λ噬菌体的四种必不可少的基因作为靶标，对CRISPR进行编程。正如他们预测的一样，携带新的CRISPR序列的细菌株系对噬菌体呈现出抵抗性。这是第一个直接通过编程实现的基于CRISPR的免疫。

这些实验结果也暗示，CRISPR的目标并不是Bolotin所设想的RNA，而是DNA。研究人员设计了两种版本的CRISPR序列，一种是反义链方向的（与mRNA和DNA位点的编码链互补），另一种是正义链方向的（仅仅与另一条DNA链互补）。尽管不同间隔的有效性不太一样，但正义链方向的序列所起的作用有力证明靶标不是mRNA，但并不是直接证据。《科学》杂志的编辑们认为做出明确的结论需要谨慎，所以van der Oost在文章中将“CRISPR以DNA为靶点”作为一种假说提了出来。

DNA是CRISPR的靶点

在从世界著名的噬菌体遗传学家Malcolm Casadaban那里了解到CRISPR时，Luciano Marraffini正在芝加哥大学完成博士学位，研究方向是葡萄球菌（Staphylococcus）。在2005年，Casadaban意识到CRISPR有可能是适应性免疫系统这一发现的重要性，所以他将这一概念告诉给每一个人。像噬菌体协会的许多人一样，Marraffini坚信CRISPR不是通过RNA干扰起作用的，因为这一机制对于克服发生在噬菌体感染过程中的爆发式增长是无效的。事实上，他认为CRISPR必须切断DNA，该功能就好像限制性内切酶的功能一样。

Marraffini殷切希望加入世界上正在研究CRISPR的顶级研究团队，进行博士后研究，但因为他的妻子在库克县的伊利诺伊（Cook County, Illinois）刑事法庭做翻译员，他觉得应该留在芝加哥。他说服Erik Sontheimer让自己加入Sontheimer的实验室，研究CRISPR。Erik Sontheimer是一名从事RNA剪接和RNA干扰工作的西北大学（Northwestern University）的生物化学家。

在搬去西北大学之前，Marraffini在完成博士研究的同时就开始了CRISPR的研究工作，研究葡萄球菌（Staphylococcus）的CRISPR系统是否能够阻止质粒接合。他注意到，一种表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）有一个间隔，与具有抗生素耐药性的金黄色葡萄球菌的质粒上编码切口酶（nickase，nes）基因的某区域相匹配。研究表明，这些质粒不能转化表皮葡萄球菌，但是能中断质粒nes序列或者匹配CRISPR位点的间隔序列，取消干扰。显而易见，CRISPR就像阻止病毒一样阻止了质粒。

Marraffini和Sontheimer想在体外对CRISPR系统进行重组，来证明它可以切割DNA。但是表皮葡萄球菌的系统太复杂，它有9个cas基因，并且基因特征不明确。于是，他们转向了分子生物学。他们修饰质粒中的nes基因，在序列中间插入自我拼接的内含子。如果CRISPR以mRNA为靶点，那么该变化不会影响干扰功能，因为内含子序列会被剪切掉。如果CRISPR以DNA为靶点，那么嵌入部分会取消干扰功能，因为间隔不再匹配。结果很清楚：CRISPR的靶点是DNA。Marraffini和Sontheimer认识到，CRISPR在本质上是一种可编辑的限制性内切酶。他们的论文第一个明确提出预测：CRISPR可以用于在异源性系统内进行基因组编辑。他们甚至提交了包括使用CRISPR在真核细胞内切割或纠正基因位点的专利申请，但是由于缺乏有效性实验，最终放弃了申请。

Cas9是由crRNAs指引并在DNA中产生双链裂断

2007年的一项研究确认了CRISPR是一种适应性免疫系统之后，Sylvain Moineau继续与丹尼斯科公司合作，研究CRISPR切割DNA的机制。但有一个问题，CRISPR在通常情况下非常高效，以至于Moineau和他的同事们无法轻易观察到CRISPR是如何消灭入侵的DNA的。但在研究嗜热链球菌的质粒干扰过程中，他们找到了突破口。研究人员发现，在少数的菌株中，CRISPR对于电穿孔法的质粒转化只具有部分保护作用。在其中一个效率低下的菌株中，研究人员可以看到呈线性的质粒持续存在于细胞中。在一定程度中，质粒干扰的过程被减缓了，以至于可以观察到CRISPR活动的直接产物。

这个菌株可以让他们仔细研究切割的过程。与他们先前的研究结果一致，这次的研究结果显示，质粒的切割依赖于cas9核酸酶。当他们对线性化的质粒进行测序时，他们发现在PAM序列（proto-spacer adjacent motif)上游，有单个精准平端切割的三核苷酸，PAM序列是一种关键性特征序列。他们扩大了分析范围，结果表明，病毒DNA也在与PAM序列有关的相同位置被切割。而且，匹配同一目标的不同间隔数量与观察到的切口数量一致。

研究结果表明，Cas9的核酸酶活性能在精准位点切割DNA，而这些点位则由crRNA的特定序列编码。

tracrRNA的发现

尽管对CRISPR-Cas9系统进行了深入研究，但还是缺失了一部分，即被称为反式作用CRISPR RNA(tracrRNA)的一个小RNA。事实上，它的发现者Emmanuelle Charpentier和Jörg Vogel并不是专门研究CRISPR系统的，他们仅仅试图鉴定微生物RNA。

1995年Charpentier从巴斯德研究所（Pasteur Institute）获得博士学位，之后在纽约做了6年的博士后研究，2002年在奥地利的维也纳大学和2008年在瑞典的于默奥大学（Umeå University）建立了自己的实验室。在化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes）里发现了一种不寻常的、可控制其传染力的RNA之后，她开始对鉴定微生物的调控性RNA感兴趣。她用生物信息学的程序检索化脓性链球菌结构的基因间的区域，假设它们可能编码非编码RNA。她发现了一些候选区间，包括CRISPR基因位点附近的一个，但是由于缺乏这些RNA本身的直接信息，研究很难继续。

在2007年召开的RNA学会会议上，Charpentier遇到了Vogel，缺乏RNA本身信息的问题得到了解决。Vogel在德国被培训为微生物学家，在乌普萨拉（Uppsala）和耶路撒冷（Jerusalem）做博士后研究期间他开始重点研究病原体内的RNA。2004年，他在位于柏林的马普感染生物学研究所建立自己的研究小组时也在继续进行这项工作。

随着“下一代测序”技术的发展，Vogel意识到大规模平行测序将会使绘制任何微生物转录组的全部图谱成为可能。他将这种方法用于幽门螺杆菌，同时用于其它细菌。Charpentier和Vogel也决定将目标转向化脓性链球菌。

此方法产生了一个惊人的结果：仅次于核糖体RNA和转运RNA之后数量第三多的RNA转录本属于一种新的小RNA，它是从紧挨着CRISPR基因位点的序列转录过来的，并且有25个与CRISPR重复序列近乎完美互补的碱基。这一互补表明tracrRNA和crRNA的前体杂交，被RNaseIII切割处理成为成熟产物。遗传删除实验证实了这个观点，即tracerRNA对处理crRNA是必不可少的，对CRISPR的功能实现也必不可少。

之后的研究揭示了tracerRNA的另一个关键作用。后续生物化学研究表明，tracerRNA不仅仅涉及处理crRNA，对Cas9核酸酶复合体剪切DNA也是必需的。

目前发现的CRISPR的功能和作用就是这些，至于CRISPR的应用留待下篇讲解。【未完待续】

（作者：马驰）

参考文献：Cell 2016;164:18-28