为对抗入侵的病原体，细胞通过改变遗传信息发展出了适应性免疫应答。在脊椎动物中，遗传变异的产生（体细胞高频突变）是抗体多样性和亲和力成熟的关键过程。活化诱导的胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase，AID）通过修饰免疫球蛋白可变区位点的脱氧胞苷碱基产生高频变异。由AID产生的脱氧尿苷在DNA中具有致突变性，因为其被错误识别为脱氧胸苷，导致C至T突变。CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）/ Cas（CRISPR-associated）是原核生物的适应性免疫系统，其降解外源DNA/RNA。CRISPR/Cas系统将外源DNA/RNA片段切割和整合至称为CRISPR阵列（array）的基因组区域。CRISPR阵列转录产生crispr-RNA，作为向导RNA（gRNA）在核糖核蛋白复合体中与Cas蛋白识别外源互补DNA/RNA，将外源DNA/RNA降解。CRISPR/Cas系统还被用作基因组编辑工具，通过定制gRNA来切割特定DNA序列。

为确定是否能够通过CRISPR/Cas系统靶向作用于AID活性，Keiji Nishida等人通过融合两种蛋白或者将SH3（Src 3同源）域附着在dCas9（Cas9核酸酶缺陷突变）的C末端上以及将SHL（SH3相互作用配体）附着在PmCDA1（AID直向同源物）的C末端上，合成复合物（靶-AID）。这些复合物产生了高效定点突变。对酵母的突变谱进行分析，结果证实，点突变主要发生在胞嘧啶，范围为3至5个碱基，位于gRNA非互补链上的前间区序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM）序列上游 -18位置附近。在靶-AID复合物中，基于核酸酶的CRISPR/Cas9系统相关毒性大大降低。PmCDA1联合突变型切割酶Cas9（D10A）保留了对非互补单链DNA的切割活性，虽然在酵母中更为高效，但也在哺乳动物细胞中诱导了缺失和点突变。添加尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂蛋白，阻断了尿嘧啶碱基切除修复通路的第一步，抑制了连带缺失并进一步提高靶向效率。通过酵母全基因组测序以及哺乳动物细胞深度测序对含有错配靶序列的区域进行潜在脱靶效应评价，结果显示，脱靶效应与传统CRISPR/Cas系统相当，插入缺失（indel）形成风险降低。

通过扩展CRISPR/Cas9系统的基因组编辑潜能，靶-AID证实了极窄的靶向核苷酸替换范围。切割酶Cas9和尿嘧啶DNA糖苷酶抑制剂蛋白可用于增强靶向效率。所降低的细胞毒性将有益于在对人工核酸酶敏感的细胞中应用。（作者：黄希瑶)

参考文献：Science 2016;353:1248-1257