混合型CRISPR基因敲除筛选(pooled CRISPR knockout screening)为我们了解某一基因的功能提供了有利技术支持。然而，该技术通过运用抗体或荧光蛋白受体，只能够识别那些影响细胞生长或活力表型或改变有限的特定标志物表达的基因。最近发表于《细胞》和《自然·方法》杂志上的4篇文章描述了能够联合混合型CRISPR筛选和单细胞RNA测序的技术，从而将每个基因敲除与这个基因对任何转录基因表达的影响联系起来(这些新方法被称为Perturb-Seq、CRISP-seq5或CROP-seq6)。这些方法扩大了哺乳动物细胞基因筛选的分辨力，其不仅增加了潜在读出值(readouts)的数目，也使得研究基因敲除对不同细胞产生的影响成为可能。

基于上述筛选策略，可以将携带不同单导向RNA(single guide RNAs，sgRNA)慢病毒混合物递送至表达CRISPR-Cas9的培养细胞上。在这些细胞中，单个sgRNA能够指导Cas9至特定基因上，从而产生一个DNA双链断裂，并且形成破坏性的插入突变或缺失突变。传统上，在所得到的具有不同基因敲除的细胞的混合物中，采用选择压力，并随后进行sgRNA表达盒(cassette)的批量深度测序(bulk deep-sequencing)，来确定各sgRNAs的生物学效应。sgRNA表达盒是从基因组DNA进行PCR扩增而来的。之后，在选择的细胞群中对sgRNA序列进行耗竭或富集，可以被用于影响感兴趣的细胞进程中的基因。

所有四项研究中的一项关键技术革新是对慢病毒载体的修饰，从而允许通过mRNAs(多腺苷酸化RNA)的深度测序来识别细胞中的sgRNA。这与来自基因组DNA的sgRNA表达盒深度测序的标准方法相反。由于sgRNA通常表达自一个RNA聚合酶III启动子区域，sgRNAs不会被多腺苷酸化。因此，用标准的mRNA测序方法并不能检测sgRNA。通过在每个sgRNA表达载体内引入一个唯一的分子条形码，作为多聚腺苷化mRNA，研究人员就能够通过mRNA测序来追踪转导细胞群内的sgRNAs。有了这些新的载体，就能够对那些转导混合型sgRNA文库的细胞群进行mRNA测序，从而能够将基因敲除与mRNAs水平改变联系起来。这些方法利用了目前在单个细胞进行mRNA测序方面的革新，这能够规模化地分析异质细胞群中的成千上万个细胞，并且大大节省成本。

研究者对这些方法进行概念验证，并且确定了在解密已知基因回路(genetic circuits)方面的准确度。例如，Dixit等人在原代树突状细胞中用67个混合sgRNAs靶向作用于24个转录因子，并且用单细胞RNA测序技术来识别那些能够激活或抑制抗病毒转录应答的已知的转录因子。Datlinger等人在白血病T细胞系中对29个基因进行混合CRISPR筛选，用单一细胞RNA测序对T细胞受体的下游信号分子进行了识别。

对这些筛选结果进行分析的一个重要挑战是，单细胞RNA序列数据存在固有的噪音干扰，并且并非所有表达特定sgRNA的细胞都会携带靶基因突变。因此，对研究者来说，开发出定制的分析方法来解释这些庞大和复杂的数据就显得比较关键。这些算法都已经被公开，其不仅使得对基因特征(gene signatures)的大规模变化的评估成为可能，而且还能够量化具有更高的测序深度的单个基因的变化。

这些方法令人印象最深的特点之一是，研究者如何处理细胞的异质性。在一个典型的在大批细胞群中进行的基因沉默或敲除筛选中，研究者常常会假设，在细胞群中所观察到的效应是同质的。因为单细胞RNA测序的一个明显优势是，通过测定转录组可暴露细胞状态的异质性，所以这些新的筛选方法使得在单个实验中能够识别基因敲除对细胞亚群的影响。

Adamson等人的研究为Perturb-seq技术如何去剖析细胞进程提供了清晰的证据。全基因组CRISPRi筛选(CRISPR 干扰；这是一种基于Cas9的技术，能够抑制基因转录，而非产生基因敲除)第一次被用于识别成千上万种调节非折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)的候选基因。筛选中被识别的约80种基因后来被perturb-seq筛选所测试，产生了约65000个单细胞转录组。用这种分析方法，在初始筛选中识别的潜在调节因子能够被分配给三种独立的UPR信号通路分支中的一种或多种。此外，研究者在UPR回路中揭示了意想不到的异质性，这是用批量分析所检测不到的。

哺乳动物基因筛选的最大障碍之一是暴露存在于生物回路中的冗余和高阶相互作用。就这点而言，这些技术为了解未来基因CRISPR筛选提供了可能。在慢病毒转导条件下，Dixit等人能够从那些含有多种独立sgRNAs的细胞中区分出含有单个sgRNA的细胞，并且对单一细胞进行转录组分析能够确定靶基因是通过相加、协同还是拮抗的方式来发挥作用。Adamson等人描述了一种能够共同表达三种独立的sgRNAs的慢病毒载体。在将来，Cpf1酶处理sgRNAs阵列的能力可能会大大简化载体构建。总之，这四项研究突出强调了CRISPR筛选的革新和单细胞转录组分析是如何协同加深我们对哺乳动物细胞调节回路的理解的。

(作者：贺利军)

参考文献：Nature biotechnology 2017;35:339-340