单倍体剂量不足指基因的一个拷贝丧失功能，通常是由无义/移码突变或小的染色体缺失引起的，由于剩下的单个等位基因不能充分弥补完整的等位基因表达，最终导致基因产物的表达降低并引起病理表型。比如抗癌基因，其表达水平十分重要，如果一个拷贝失活，另一个拷贝就可能不足以维持正常的细胞功能，从而导致肿瘤发生。对于基因表达不足引起的疾病，有哪些治疗方案? 一种可行的选择是通过靶向增强其转录来恢复正常的基因表达水平。Matharu等人近期报道了一种基于CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）的基因激活方法，该方法可以以组织特异性的方式增强正常内源性基因的表达，为基因剂量相关疾病基因调控疗法的开发奠定了基础。

基于CRISPR的基因编辑的应用包括使用与蛋白质域融合的催化失活的Cas9酶（dCas9）来调节转录的技术。这些融合蛋白可以通过向导RNA（guide RNAs, gRNA）募集到特定的基因组位置——包括启动子和顺式调控元件(如调节基因表达的增强子)，它们调控着基因表达。如果募集位点具有转录能力，则结果是转录的激活（CRISPRa）或抑制/干扰（CRISPRi）。虽然这一策略已应用于人类细胞培养和动物模型，但利用CRISPRa治疗病理性基因表达的最终目标尚未完全实现。Matharu等人在严重早发性肥胖小鼠模型中，使用CRISPRa将两个单倍体剂量不足的基因表达恢复到生理水平，这两个基因分别是single-minded 1 (Sim1)和黑素角蛋白4受体（melanocortin 4 receptor, Mc4r）。这两种基因的单倍体剂量不足均会导致人类严重肥胖，之前在小鼠中的研究证实，蛋白SIM1和MC4R通过在下丘脑的表达来控制饮食行为；因此，相关的干预治疗将特异性地靶向下丘脑中的基因表达。

由于Sim1和Mc4r在多个组织中均有表达，因此第一个重要的步骤是确定是否可以以组织特异性的方式调节表达。研究者测试了两种方法，都集中于Sim1：①用CRISPRa靶向残存的功能性Sim1基因的启动子，以进一步增强Sim1在已经活跃区域的表达;②用CRISPRa靶向一个270 kb的远端增强子，该增强子专门控制Sim1在下丘脑中的表达。两种方法都被用于表达CRISPRa（融合到转录激活因子VP64上的dCas9）的转基因动物中，以及重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)介导的CRISPRa直接进入下丘脑。在所有情况下，下丘脑Sim1表达均恢复到野生型水平且小鼠没有变肥胖，证明通过增强内源性基因表达可以强有力地预防单倍体剂量不足的表型。有趣的是，研究者发现可以通过靶向下丘脑增强子而不是Sim1启动子来调控下丘脑中Sim1的表达，这表明为了获得组织特异性的转录修饰，可能需要将CRISPRa部署到组织特异性的调控元件上。将以rAAV为载体的CRISPRa注射到Mc4r单倍体剂量不足小鼠的下丘脑中，同样可以防止肥胖，进一步证明了这种方法的强度。

该策略阐释了一种治疗基因表达障碍的重要新方法，并提出了扩展CRISPRa和CRISPRi技术应用范围的可能性，比如治疗致病基因过表达的疾病，特别是癌症。例如，在一部分儿童T细胞急性淋巴细胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia, T-ALL)患者中，体细胞突变导致一种高度活跃的增强子形成，这种增强子驱动致癌TAL1基因的过表达。此外，研究证实MYC基因在人B细胞急性髓性白血病(acute myeloid leukemia, AML)中的表达依赖于一个1.7千碱基（1.7-megabase）的远端增强子元件。这两项研究均表明，破坏这些增强子会对癌细胞的存活产生负面影响，这为CRISPRi作为一种灭活促癌增强子的治疗方法提供了依据。虽然转录因子如TAL1和MYC属于最强致癌蛋白，但事实证明，用小分子抑制剂靶向它们极具挑战性。Matharu等人的研究结果表明，可以通过减少抑癌基因的转录来绕过蛋白质靶向治疗。

Matharu等人研究的一个关键进展是他们使用rAAV在体内递送CRISPRa。基于CRISPR的治疗方法要想应用于人类，可能需要将其包被在病毒中，并通过静脉注射，因为大多数靶细胞类型无法直接体外操作和植入。rAAV是一种非致病性病毒，具有很高的传递潜力，是将CRISPR试剂有效地引入人类细胞较为可行的选择。CRISPRa和CRISPRi方法的另一个好处是无需修饰基因组即可调节基因表达，从而避免潜在的脱靶突变。因此，将CRISPRa与rAAV结合用于治疗体内的基因表达障碍，是基因表达疗法向前迈出的重要一步。

尽管Matharu等人证明基于CRISPR的单倍体剂量不足的基因上调可以预防肥胖，但这项研究还提出了一个重要的问题，即疾病表型是否会发生逆转。因为研究人员在小鼠开始肥胖前、4周大的时候给它们注射了CRISPRa，他们并没有考虑在以后的生命中如何应对表型的改变。而人类的许多单倍体剂量不足的疾病可能只有在疾病表型部分或完全确定后才在治疗上采取行动。未来实验的方向应该是测试靶向基因表达以逆转单倍体剂量不足表型的治疗效果。此外，重要的是要认识到许多增强子是动态变化的，这意味着它们可以在特定的发育阶段起作用并随时间改变其组织特异性。比较幸运的是，研究者可以用一种发育稳定的组织特异性增强子，尽管目前还不清楚这种情况在针对其他单倍体剂量不足基因的增强子时是否也存在。

自然发生的和致病的基因调控DNA元件提供了一个针对基因表达的治疗途径。Matharu等人的研究结果强调了识别和详细描述调控基因表达的增强子的重要性。大规模的研究已经在数百种人类细胞类型中发现了数千种潜在的增强子。然而，代表不同疾病状态的细胞类型，特别是来自人类患者的细胞类型，仍然没有被充分地研究。了解这些细胞类型中全部的基因调控元件及其靶基因，可能为基于CRISPR的治疗提供重要的参考和依据。

（编译：贾盛崧）

参考文献：Science 2019;363:231-232