一个科学发现引出的医学思考

医 学的进步总是与科学上的发现脱不了干系，RNA干扰（RNA interference，RNAi）就是如此，它的发现给医学的未来点亮了一盏明灯。RNAi是一种调节基因表达的方法，它无所不在、非常普遍。这一调 节过程是通过一种小分子双链RNA实现的，它只有大概21个核苷酸，配对得并不严丝合缝，这种小分子RNA（microRNA，miRNA）的前体是较长 的茎环结构RNA。在这种双链RNA与胞质内的RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）结合后，1条链被移除，留下了另一条链，等待与跟自己有一部分互补序列的信使RNA（messenger RNA，mRNA）配对结合。RISC在捕捉到猎物mRNA后一定会痛下杀手，促使猎物降解，使之不能翻译成蛋白质。小分子RNA和RNAi的基因沉默途径最早发现于20世纪90年代，起初是在植物、线虫和果蝇中发现了这一途径。在这些有机体中，小分子RNA在调节生长发育过程中的基因表达改变、预防病毒感染方面起着举足轻重的作用。

2001 年，Elbashir等又在哺乳动物中发现了RNAi现象。他们的研究显示，设计一种与胞内mRNA序列完全契合的小分子双链RNA[被称为小干扰 RNA（small interfering RNA，siRNA）]并转染进入细胞后，导致了靶mRNA的降解，选择性敲低或沉默了某一基因表达。这些siRNA在胞内也与RISC结合在一起，从而 引导了RISC上酶对靶mRNA的裂解。这一发现不由使人联想——是否能利用这一原理来敲低致病基因呢？由此带来了一个崭新治疗领域的兴起。研究人员很快证实，敲低HIV基因或HIV受体能抑制HIV复制。此外，Fas是细胞表面重要的死亡受体，研究表明如果注射靶向这种受体的siRNA将对小鼠产生保护作用，使其幸免于致命的暴发性肝炎。

RNAi类药物的研发

理 论上来说，利用RNAi能敲低任一mRNA，拓展了药物靶点的范畴，使其不再拘泥于酶和受体这些传统上用小分子药物来“靶向”的“标”。然而基因敲低 （gene knockdown）的特异性并没有最初想象得那么好，这是由于基因序列只要有一部分与siRNA中的一条链配对就会被“捕捉”，基因沉默逐渐放大、超出 靶基因范畴，此外siRNA作为一种“外来物”，还会刺激固有免疫系统的病毒RNA受体——Toll 样受体，由此导致干扰素的产生。事实上，早期siRNA实验之所以看起来颇具临床前景可能正是由于这些在“脱靶效应”（off-target）下产生的干 扰素。尽管面临诸多不利，但科学家们很快发现了siRNA的化学修饰。化学修饰意义重大，能使siRNA在不牺牲对靶基因精确“沉默”的同时消除脱靶效 应。综合所有这些信息，促使一些人将siRNA奉为下一代新药。很快，数百家生物科技公司开始投身于RNAi类药物的开发，大型医药公司也准备在这个新兴 市场上分一杯羹。

然而，当证实把小分子RNA送入细胞质与RISC结合是件相当困难的事后，这种热情很快消退。把带负电荷的siRNA递送进细胞有两个瓶颈——很 难穿过同样带负电荷的细胞膜，而且即使进入细胞也很难从包涵体中释放出来。这些障碍同样困扰着其他小分子寡核苷酸药物的发展，不同于siRNA，寡核苷酸 调节基因表达的机制是反义抑制或对mRNA前体（pre-mRNA）的剪接抑制。然而，siRNA优于其他反义寡核苷酸。一旦与RISC绑定，siRNA 的活性链就得到了保护，不会再被细胞内的RNA降解酶（RNA-degrading enzymes，RNases）所“消化”，通常会在细胞内以活性形式稳定地停留数周。更重要的是，同一siRNA复合物能催化多种mRNAs的断裂。由 于RNAi的这种催化特性，要沉默一个靶基因估计每个细胞中只需不过几百个siRNAs。

肝脏是机体最主要的血液过滤 器官，有用的代谢物在这里被与有害毒素和粒子区分开来，正因为此，向肝细胞递送RNAi治疗要比其他脏器容易得多。出于这一点，siRNA药物的研发大多 集中在肝内靶点上。而且，肝脏还是体内最大的“制造厂”，很多代谢物和分泌蛋白都在此“生产”，对肝脏进行基因敲低对很多疾病都有治疗潜力。比如由蛋白编 码基因突变导致的几种罕见病，这些蛋白由肝脏产生，有血红素生物合成所必须的酶、胆固醇代谢所需酶、凝血蛋白和补体；再比如常见的代谢综合征，肝脏的蛋白 合成在其中扮演着关键角色；此外还有那些主要累及肝脏的疾病，如感染性肝炎和非酒精性脂肪肝。

细胞递送难题的两种应对策略

脂 质纳米粒（Lipid nanoparticles，LNPs）包含带阳离子的脂质，正好可与带阴离子的RNAs结合，在肝脏内，它们被肝细胞所摄取，从而敲低相应基因表达。最 早用第一代LNPs开展的靶向肝脏的临床试验治疗指数往往不佳，提示安全性差。通过改善脂质组成、对其携带的RNAs进行化学修饰，新一代的LNPs能够 在1个月内将肝脏内的靶基因——转甲状腺素蛋白基因（该基因突变会导致淀粉样变性）敲低80%～95%，而没有任何严重不良事件。目前，靶向转甲状腺素蛋白基因的LNPs（patisiran，0.3mg/kg，每三周一次）已经进入了3期研究，用于治疗家族性淀粉样多发性神经病变——一种致命的进行性疾病。Patisiran治疗这种疾病的一项开放性延伸研究已经得出了令人振奋的结果：相比于历史对照病例神经学得分的下降，patisiran组患者的神经学得分有所改善。

另一种向肝细胞递送RNAs 的方法是让siRNAs的一端与多价糖N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）结合，这种糖能被肝细胞表面的去唾液酸糖蛋白受体所特异性地识别。 GalNAc-siRNAs结合物只需皮下给予，能在1个多月内将肝基因表达敲低近95%，很少甚至没有毒性。靶向转甲状腺素蛋白基因的GalNAc- siRNAs结合物（revusiran）现正在进行3期研究，用于治疗由这一基因突变所致的淀粉样变心肌病。与LNPs相比，GalNAc- siRNAs结合物更容易生产，而且尽管积累的经验还不多，但已经显示出了更好的耐受性，并且应用起来前者需静脉注射，而后者只需皮下给予，优势不言自 喻。未来，这种结合物很可能成为肝脏内基因敲低的一种方法。用这种方法敲低特定基因用于治疗疾病的1期研究已经开展了多项：敲低前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9）用于治疗家族性高胆固醇血症；敲低补体C5用于治疗阵发性睡眠性血红蛋白尿、溶血尿毒综合征以及其他一些补体介导的疾病。

一种不同于传统的治疗血友病的方法——用 结合了GalNAc的siRNAs敲低抗凝血酶3，也正在进行1期试验。这种治疗并非是要替代缺失的凝血因子，而是试图通过阻碍凝血酶的失活来止血。对于 已经对替代凝血因子产生了抑制性抗体的血友病患者而言，这样一种疗法意义尤其重大。在为数不多接受了这种疗法的血友病患者中，凝血酶的产生和出血时间得到 了改善，重症患者在几个月内都没有出现明显的出血事件。

另一种RNAi疗法

另 一种RNAi疗法是用小分子寡核苷酸模拟或拮抗内源性微小RNAs（microRNAs）。人类表达的微小RNAs在1000种以上，而且表达模式也随细 胞类型以及分化、活化的状态不同而各异。每种微小RNA通过部分互补序列能抑制数百种基因，但对每种基因抑制的程度往往不如siRNAs，因为后者与靶基 因是完全互补配对的。由于影响着众多基因，所以微小RNA类的药物相比siRNAs更难设计，也更难控制。以微小RNA为靶点的治疗如何向细胞内递送仍是 个难以逾越的坎，肝脏成了临床研究的热点。肝细胞内最丰富的一种微小RNA——miR-122起着稳定丙肝病毒（hepatitis C virus，HCV）基因组RNA的作用，并且是病毒复制所必须的。

在 最近一项关于HCV感染的2期研究中，给予5周剂量的miR-122反义寡核苷酸（miravirsen）后导致病毒血症出现了剂量依赖性的降低，在用药 剂量最大的9例患者中，4例患者的血中已经检测不到病毒。值得注意的是，miravirsen治疗过程中没有出现耐药性，这可能是因为所有病毒株全都要 “仰仗”miR-122。一项1期研究最近发布的期中分析结果显示，一种结合了GalNAc的miR-122拮抗剂（RG-101）在使用单剂后病毒血症 下降了4个数量级，而且没有任何严重毒性。然而，随着强悍病毒抑制药物的获批——它 们能在短疗程内治愈HCV感染，反义miRNAs将再无缘这一市场的角逐。在癌细胞内，有些miRNAs下降得非常厉害，特别是在恶性程度极高的癌症如混 合谱系白血病、三阴乳腺癌中这一点尤为明显，针对这些具有抑癌作用的miRNAs进行替代治疗无疑是个非常诱人的策略。能增强心功能的miRNAs也已经 被发现。然而，未来以miRNA为基础的上述指征的治疗必须要解决肝外递送的问题。

下一代新药舍它其谁！

如果有适用于临床的方法能将 小分子RNAs递送到肝以外组织的话，RNAi类治疗的应用将得到极大扩展。机体的粘膜表面很容易够到，也相对容易靶向。然而，尽管将GalNAc替换为 能与细胞类型特异性的细胞表面受体结合的靶向部分看似是个不错的方法，但早期用这种方法来靶向体内组织的尝试很多却并不奏效。另一种靶向性递送RNA的可 行策略是把siRNA的一条链与RNA适体结合，所谓RNA适体是经筛选得到的一段RNA，它与特定细胞表面受体具有高亲和力，能选择性与之结合。适体 -siRNAs目前的确已经在小鼠中用于敲低癌细胞和淋巴细胞的基因表达，对应功能分别是抑制肿瘤生长以及HIV传播、感染。另一种更普遍的做法是利用靶 向性纳米颗粒，但要想有效地递送到组织，同时避开肝脏及其他脏器的“捕捉”，仍是个巨大挑战。

在过去两年中，RNAi类药物在临床上获得了快速发展，在人类肝脏中能使基因明显敲低，并且是可耐受的。尽管对基因敲低的担心从未停止——担心任何基因的强力敲低都可能带来毒性，但研究表明一些被靶向基因的遗传缺陷成年人可以耐受。除了前面已经提到过的治疗指征外，接下来的两年 内还应该开始着手进行siRNA治疗卟啉病、铁过载、HBV感染的临床评价。在不久的将来，必将迎来相关临床前和临床研究的浪潮，最先可能发生在罕见病治 疗领域，随后将扩展到更常见的疾病。近期临床研究得到的可喜结果以及对灵长类或小型动物开展的临床前研究无不昭示了这样一点：RNAi类药物正蓄势待发， 下一代新药舍它其谁！

（作者：白蕊）

参考文献：Journal of the American Medical Association 2015; 313:1207-1208