CRISPR-Cas9在体外破坏基因和精确设计细胞治疗的能力改变了分子医学。随着新编辑模式的成熟，可以精确插入大的DNA片段，基因组工程师将能够处理超过75 000个与人类疾病相关的致病遗传变异。
CRISPR-Cas9在被提出十年后，作为研究试剂和分子医学取得了显著进展。细菌核酸内切酶已被证明是一种多功能的基因编辑工具，可将移码突变引入靶基因。自2016年首次进入人体试验以来，CRISPR-Cas9已在约46个抗恶性肿瘤嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor, CAR）-T细胞疗法的体外试验、8个抗镰状细胞病和β-地中海贫血的工程化CD34造血干细胞试验以及一个治疗1型糖尿病的异基因β样祖细胞试验中使用。体内治疗也在Leber先天性黑蒙、遗传性甲状腺素淀粉样变性和遗传性血管水肿患者中进行了试验。在许多试验中，Cas9被证明擅长消除异常的基因功能。但人们越来越多地将注意力转向基因编辑工具，这些工具可以引入DNA改变，而没有CRISPR-Cas9的致病弱点：修复产生基因毒性变化的双链断裂（double-strand break, DSB）的修复副产物，这会引起基因毒性变化。除了更好的安全性外，这些新工具还有望使基因组工程师能够解决更广泛的遗传疾病。
CRISPR-Cas9已被证明是一种多功能的基因编辑工具，可补充锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶（transcriptional activator–like and effector nuclease, TALEN）和巨核酸酶。Cas9核酸内切酶通过可重编程的单导向RNA（sgRNA）定向到靶基因座，在基因组中产生DSB，然后由内源性细胞酶修复。在没有DNA供体模板的情况下，非同源末端连接（non-homologous end-joining, NHEJ）可以通过非生产性过程产生插入和删除（insertion and deletion, indel）副产物，从而使目标位点的基因失活。在供体模板存在的情况下，同源性定向修复（homology-directed repair, HDR）能够选择性对称或不对称校正基因组位点。DSB的NHEJ和HDR结果的混合意味着Cas9通常可以在靶点上或靶点外产生大量不需要的indel（例如易位和大量缺失），从而导致p53激活。HDR在有丝分裂后细胞（如神经元）中的低效率和低水平意味着插入而不是破坏基因仍然是一个巨大的挑战。
相比之下，将要进入临床测试的碱基编辑系统很少产生DSB，也不需要供体DNA模板。在这些系统中，sgRNA将Cas9内切酶引导至包含目标DNA碱基的3-至5-bp编辑窗口，然后通过脱氨酶转变为另一种碱基。腺嘌呤和胞嘧啶碱基编辑器有效地介导了所有四种可能的转换突变（C→T、 A→G、 T→C、 G→A） ，在静止细胞和分裂细胞中都起作用，并且与低indel频率相关（尿嘧啶糖基化酶抑制剂结构域增加后者的保真度）。然而，不同细胞类型的基本编辑效率不同；有些脱氨酶也会产生不受欢迎的旁观者DNA突变或编辑RNA。到目前为止，低效率的C→G转化是唯一一种可接受这种酶的颠换突变（即嘌呤到嘧啶，或嘧啶到嘌呤），颠换占遗传病的30%。
近期，向临床迈进的另一种系统是引物编辑。引物编辑器包含一个与Cas9内切酶融合的逆转录酶，该逆转录酶由引物编辑sgRNA（prime-editing sgRNA, pegRNA）引导，结合并切割基因组DNA，留下单链DNA序列，然后引导pegRNA延伸部分的反转录。从基因组DNA链直接合成产生一个包含编辑核苷酸的延伸3’ DNA flap，随后通过5’ flap切除、连接等将其并入基因组。在缺口处加入额外的sgRNA并修改未编辑的靶DNA链可以减少indel副产物。总的来说，该方法不仅能够精确插入小插入和目标删除，而且能够实现所有12个碱基的转换，没有DSB，以及indel副产物水平低。不利的一面是，编辑效率在不同的细胞类型、基因座和编辑序列之间差异很大。
最后，Cas工程重组酶/整合酶和转座酶系统因其将千碱基大小的片段插入基因组DNA的潜力而备受关注。早在2016年，dead Cas（dCas）-Gin重组酶的融合版本在哺乳动物细胞中的活性就很低。然而，严格的基因组序列要求（两个sgRNA的重组酶切割位点基序和侧翼靶点）意味着它们只能应用于少数基因座。另一个有趣的选择是CRISPR-Cas12k相关转座酶，它支持插入高达10 kb的DNA；然而，到目前为止，这些在哺乳动物细胞中还不起作用。另一种尚未发表的方法可能是设计逆转录转座酶，将RNA序列插入基因组中的“安全港”逆转录转座子。
随着工程师不断完善编辑工具（例如，通过搜索具有不同活性或大小的Cas变体；为特定靶点定制工程酶；或通过化学、结构或核苷酸修饰改变RNA引导），编辑的准确性和效率将提高。同样，更好地理解正在进行编辑的生物背景（例如，错配修复酶在决定不同细胞中进行引物编辑的结果中的作用）将提高不同细胞背景下编辑的可重复性。
编辑策略也可能趋同；例如，引物编辑与重组酶技术的组合使得重组酶基序可以潜在地引入人类基因组的任何地方，预示着一个时代的到来，即在任何所需的位点都可以进行5000 bp以上的DNA插入，不会有双链断裂。
CRISPR-Cas9在体外破坏基因和精确设计细胞治疗的能力改变了分子医学。随着新编辑模式的成熟，可以精确插入大的DNA片段，基因组工程师将能够处理超过75 000个与人类疾病相关的致病遗传变异。
参考文献：Knock-in on CRISPR’s door[J]. Nature Biotechnology,2022,40:803.