骨肉瘤（Osteosarcoma）是最早发现的人类癌症。它是在南非一块170万年前的古人类化石中发现的，也在一块7 700万年前的恐龙标本中被确认。尽管骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤，但它很少见，据估计在美国每年诊断出800～900例。大多数病例发生在10～30岁的儿童和青年人中，青春期发育高峰期发病率最高。最常见的肿瘤部位是纵向骨生长最广泛的部位：膝盖（股骨远端和胫骨近端）和肩部（肱骨近端）。第二个发病高峰（10%的病例）发生在60岁以上的人群中，通常与佩吉特氏病有关，可能代表一个独特的生物学过程。本综述侧重于青少年和年轻人中更常见的第一个高峰。
大约10%至15%的新诊断骨肉瘤患者存在转移性疾病，主要发生在肺部。局限性骨肉瘤患者的5年生存率约为60%，但转移或复发患者的5年生存率仅为20%。尽管在过去三十年中生存率没有提高，但骨肉瘤基因特征的最新进展和临床试验策略的发展表明，我们正处于变革的风口浪尖。
分期与预后
大多数患者表现为骨痛复发症状，通常导致影像学检查提示骨肉瘤（图1A）。通过活检进行诊断（图1B）。肿瘤分期有助于手术治疗和预后。肌肉骨骼肿瘤学会（Musculoskeletal Tumor Society, MSTS）和美国癌症联合委员会-国际抗癌联盟（American Joint Committee on Cancer–International Union against Cancer, AJCC-UICC）的分期系统是应用最广泛的系统之一。1980年采用的MSTS系统基于肿瘤分级和发病部位。大多数患者表现为IIB期骨肉瘤，表现为高级组织学特征，延伸至骨皮质至骨膜，无转移。更新的AJCC-UICC分期系统使用肿瘤-淋巴结转移（tumor–node–metastasis, TNM）分期，但也包括肿瘤分级。无论采用哪种分期系统，大多数肿瘤都是直径≤8 cm且无转移的高级肿瘤，在AJCC-UICC分期系统中为IIA期，在MSTS系统中为IIB期。
非治疗因素和治疗相关因素都会影响预后。在一项涉及2 260名高级别骨肉瘤患者的研究中，与不良预后最密切相关的治疗前因素是存在转移和轴向骨骼定位。导致生存率低的治疗后因素包括手术切除不全和化疗反应差。
骨肉瘤的治疗进展
骨肉瘤的主要治疗方法是手术切除原发肿瘤，最初是通过根治性切除（截肢）完成的。20世纪70年代，在骨肉瘤系统治疗的同时引入了保肢手术，现在90%的患者使用保肢手术。保肢手术包括完全切除肿瘤，然后进行骨骼和软组织重建。新辅助方法提供了通过检查切除标本中治疗诱导坏死的数量来评估原位化疗效果的机会（图1B和1C）。疗效评估为良好(≥90%坏死）或较差（<90%坏死）。经过10至12周的标准新辅助治疗后，约55%的患者有良好的反应，5年生存率约为75%。对于反应差的患者，5年生存率约为45%，仍然大大超过常规化疗前的生存率。术前（或新辅助）化疗现已成为标准做法，尽管一项比较术前化疗与术后立即手术辅助化疗的随机研究显示，两者的疗效无显著差异。
20世纪70年代和80年代发展起来的针对骨肉瘤的有效全身化疗，为辅助治疗（除手术外）对癌症生存的影响提供了最清晰的证据之一。在化疗前，80%以上的局限性骨肉瘤患者在2年内死于转移性疾病，主要是肺部转移。1982年，一项随机多机构研究评估了肢体非转移性骨肉瘤患者的辅助化疗。在接受完全手术切除后，患者被随机分配接受大剂量甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂（MAP）以及其他活性较低的药物治疗，或进行观察。2年时，观察组患者的无进展生存率为17%，接受化疗的患者为66%。
目前，青少年和年轻人可切除骨肉瘤最常见的治疗方法包括新辅助（术前）MAP化疗，术后恢复后再进行额外的周期（术后辅助化疗）。对于老年患者，大剂量甲氨蝶呤的使用常常被忽略，因为在这个年龄组中毒性作用的发生率较高。
其他研究试图通过限制阿霉素或顺铂的长期副作用来改变MAP化疗，并用异环磷酰胺、依托泊苷或两者替代，但在新诊断骨肉瘤患者中，这些替代方案均未证明优于MAP。
转移性和复发性疾病的治疗
转移性疾病患者的初始治疗方法与局限性疾病的治疗方法相同：使用新辅助化疗，随后尽可能切除原发肿瘤和转移性疾病的所有部位。手术切除所有明显的疾病与提高总体生存率相关。由于大多数复发性疾病患者有肺转移，手术切除通常需要切除肺部疾病。最常见的挽救性化疗方案包括异环磷酰胺和依托泊苷，尽管手术切除后使用系统疗法提高总体生存率的证据有限。总体生存率仍然极低，长期生存率低于20%。
作为开场白的过去
在20世纪70年代，人们对于全身化疗在实体肿瘤治疗中的作用都相当悲观。骨肉瘤治疗的进展是革命性的。骨肉瘤的个体化治疗是目前骨肉瘤研究的主要方向。骨肉瘤可能是人类所有肿瘤中最极端的一种，其基因的复杂性最近才被人们认识到。为了将这一信息转化为成功的治疗，骨肉瘤亚群必须根据基因驱动因素和其他生物决定因素（如患者和肿瘤的免疫状态）来确定。需要对这种罕见肿瘤的基因特征进行复杂的临床评估，并在涉及肿瘤生物亚群的临床试验策略方面取得进展。
骨肉瘤遗传学与基因组学
骨肉瘤的遗传易感性长期以来被认为存在于Li-Fraumeni综合征（TP53突变）或遗传性视网膜母细胞瘤（RB1）患者或家族中。骨肉瘤风险增加也是由DNA解旋酶（RECQL4、WRN和BLM）和核糖体蛋白缺陷（Diamond-Blackfan贫血）引起的几种罕见遗传综合征的特征。最近一项涉及1 244名骨肉瘤患者但无遗传风险家族史的研究扩展了我们对遗传易感性的理解。在该研究中，在上述基因以及许多其他基因中观察到致病性种系突变，包括CDKN2A（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A）。在大约1/ 4的患者中发现了已知或可能有害的癌症易感基因变体或已知人类致病基因的有害变体，TP53突变频率最高（1 004名患者中有4.4%）。罕见的致病性变体在DNA修复基因中高度富集（例如BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、RAD51、ATM、WRN和RECQL4）。
体细胞突变是癌症的普遍特征，对靶向突变的认识导致了对癌症治疗产生重大影响的精准疗法。为了在骨肉瘤方面取得类似的成功，许多研究人员于2014年开始探索骨肉瘤基因组，一系列引人注目的研究将全外显子组测序和全基因组测序应用于骨肉瘤肿瘤标本。显然，准确确定突变频率需要进行全基因组测序，以识别小突变和结构重排。
全基因组测序显示高度重排的基因组具有广泛的拷贝数畸变和肿瘤抑制因子的频繁破坏。一整套机制留下了可识别的足迹——例如，染色体碎裂（广泛的基因组重排和一条或几条染色体上DNA拷贝数水平的振荡模式）、kataegis（局部链特异性超突变，通常与染色体重排相邻），和断裂-融合-桥循环（来自不同染色单体或染色体的断裂端融合，产生不稳定的双着丝粒染色体）（图2）。革命性的长读DNA测序技术的出现，大大提高了精确定位骨肉瘤等癌症中高度重排基因组的可能性。只有通过使用避免脱钙剂降解核酸的方案收集适当的临床生物样本，才能实现新技术和现有技术促进骨肉瘤研究和治疗的潜力。
骨肉瘤基因组中存在拷贝数畸变。一项与种系易感性数据一致的发现是，TP53中最常见的体细胞突变，一个等位基因的突变或破坏以及另一个等位基因的缺失，导致大多数肿瘤中的TP53缺失。细胞周期调节因子CDKN2A和RB1的突变也很常见，可能与TP53突变一起发生。这些突变导致正常细胞周期控制的丧失，并为DNA损伤的积累提供肥沃的土壤。细胞周期控制的异常状态导致骨肉瘤特有的复杂基因组重排，这一观察结果与确定TP53突变与一些成年癌症患者中的基因组重排高度相关的数据一致。
骨肉瘤中缺失的是在其他癌症中观察到的信号基因的高频激活突变。在骨肉瘤中，基因扩增和过度表达可获得同等的功能增益。通过整合基因拷贝数和表达数据，已经确定了几个含有目标基因的候选途径，包括磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K）——雷帕霉素（mTOR）靶蛋白途径（PIK3CA、mTOR和AKT1）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor, IGF）途径（IGF1R）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）途径（VEGFA和KDR）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）途径（PDGFRA）、KIT和MYC途径，以及细胞周期途径（CDK4、CCNE1和CCND2），其中许多是可用药物的靶向。除PI3K-mTOR途径外，该途径通常由PTEN缺失激活，最近提名的候选药物靶点主要位于基因扩增频繁的区域。鉴于骨肉瘤的罕见性和大量候选基因可通过拷贝数和基因表达研究提名，识别临床前研究对于确定临床验证的最佳生物标记物是必要的。MYC癌基因扩增与不良结局显著相关，被认为是近期临床试验研究的候选生物标志物。
骨肉瘤基因组的不稳定性可能很容易被利用。与其他儿科癌症的基因组相比，骨肉瘤基因组具有相对高水平的同源重组缺陷特征（BRCA1/2缺陷癌症的典型特征），表明在与BRCA1/2突变相关的癌症中具有活性的多聚ADP-核糖聚合酶[poly(adenosine diphosphate–ribose) polymerase, PARP]抑制剂，在骨肉瘤中可能具有活性。
针对已知基因改变的癌症疗法的发展对癌症治疗产生了重大影响。这种方法在骨肉瘤中具有挑战性，因为骨肉瘤缺乏常见的激活激酶突变。相反，骨肉瘤的特点是频繁的基因扩增和大量的遗传变异。骨肉瘤突变模式的复杂性使得利用其他肿瘤的数据预测化疗的基因靶点变得复杂。尽管在高度集中的基因扩增中观察到了一些候选靶点（例如IGF1R、CCNE1和MYC），但许多其他靶点位于可能包含多个候选靶点的较大的拷贝数增益片段中。例如，三个候选者PDGFRA、KIT和KDR(VEGFR2)密切相关，并且通常是共扩增的。其他大的基因密集区（高度表达的染色体片段）可能包含一个以上的重要驱动因素。这些区域是综合分析的对象，使用高通量筛选技术，如聚集的规则间隔短回文重复序列和相关的Cas9内切酶（CRISPR-Cas9）系统，可能有助于确定目标的优先次序。这些技术并不局限于基因扩增区域，可以识别不是由拷贝数或突变驱动的药物靶基因，而是由表观遗传过程驱动的药物靶基因，表观遗传过程也可能提供干扰癌症驱动因子表达的靶基因。
尽管扩增靶点可以根据频率、拷贝数和表达情况进行优先排序，但没有一种方法可以仅根据这些信息预测药物敏感性。鉴于骨肉瘤的罕见性和我们对这种基因异质性肿瘤进行分组的能力有限，基于基因特征的靶向治疗的策略具有挑战性。在一种新的方法中，将患者的新鲜肿瘤样本植入免疫功能低下的小鼠，生成患者来源的异种移植物（patient-derived xenograft, PDX）。然后用遗传方法分析PDX，以确定候选药物靶点。PDX中针对这些靶点的药物反应用于设计患者特异性方案。尽管这种方法在应用于PDX模型时令人鼓舞，但对患者的研究仍在发展中。要将PDX方法实时应用于患者，需要应对多种挑战，包括获取相关活检标本、获取肿瘤特征技术以及实现临床合理的分析时间表。除此之外，还需要对骨肉瘤有活性的已经批准或正在研究药物。
骨肉瘤的免疫治疗
利用免疫系统治疗骨肉瘤可以避免解决其基因组复杂性问题，但有关免疫治疗的数据并不令人鼓舞。骨肉瘤具有适度的错义率、新抗原产生突变率以及表观遗传学确定的候选免疫治疗靶点的再表达率，例如癌－睾丸抗原（在生殖细胞中表达但在正常组织中不表达的蛋白质）。癌－睾丸抗原的过度表达可能是骨肉瘤亚群的特征，这些骨肉瘤易受过继性T细胞治疗的影响。
骨肉瘤的免疫治疗可追溯到1891年，当时被认为是癌症免疫治疗之父的William Coley报告说，刺激来自细菌的热灭活毒素（科利毒素）的炎症反应可导致包括骨肉瘤在内的患者的肿瘤反应。随着时间的推移，毒性作用和缺乏可重复性降低了人们对这种方法的兴趣，尽管对Coley数据的回顾性分析表明骨肉瘤患者受益。
人们的兴趣转移到了新的免疫兴奋剂，如mifamurtide（胞壁酰三肽），一种卡介苗的合成衍生物，在一项随机3期研究中进行了测试。最初没有报告任何益处，但一份随访报告表明，在化疗中添加mifamurtide可使6年总生存率从70%提高到78%。这种没有明显统计优势的微小改善阻止了美国食品药品监督管理局（FDA）于2007年批准mifamurtide。与FDA的决定相反，2009年，欧洲药品管理局根据对相同数据的审查批准了mifamurtide，目前正在欧洲和墨西哥对高危骨肉瘤患者进行研究。
研究表明，α-干扰素免疫疗法对骨肉瘤有好处，并对标准化疗反应良好的患者进行了评估。患者被随机分配接受四个额外的MAP周期，使用或不使用α-2b干扰素，干扰素持续每周使用长达2年。由于干扰素组实际接受干扰素治疗的患者数量有限，以及由于毒性作用而中断治疗，该研究受到影响。中位随访44个月，3年无事件生存率为76%，研究组之间无显著差异。长期随访仍在继续。
工程抗体已经在几种情况下进行了抗骨肉瘤的试验。人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2，也称为ErbB2）在骨肉瘤表面表达的发现，导致了对HER2单克隆抗体曲妥珠单抗（trastuzumab）联合化疗治疗肿瘤表达HER2的转移性骨肉瘤患者的评估。不幸的是，这项2期试验没有显示曲妥珠单抗比单纯化疗有任何优势。基于抗体的免疫检查点抑制剂，在许多实体瘤中已被证明具有活性，可释放对免疫反应的抑制，从而实现对肿瘤的免疫控制。不幸的是，对程序性死亡受体1（programmed death 1, PD-1）抑制剂彭布罗利珠单抗（pembrolizumab）的两项单药研究显示，复发性骨肉瘤患者的活性最低。
经修饰后表达特异性嵌合抗原受体的T细胞（CAR-T细胞）在血液肿瘤中具有明显的疗效。这种方法在肿瘤过度表达HER2的难治性骨肉瘤患者中进行了试验。在接受HER2特异性CAR-T细胞治疗的14名患者中，有3名患者病情稳定，且在最后一次随访（290至584天）时均存活。对这些数据的解释很复杂，因为患者在接受CAR-T细胞输注后进行了肿瘤切除。在一项正在进行的研究中，正在复发性骨肉瘤中测试的另一个CAR-T细胞靶向在大多数骨肉瘤中高度表达的双唾液酸神经节苷脂GD2。使用重组T细胞受体（T-cell receptor, TCR）的过继细胞疗法也在骨肉瘤中进行了试验。一名患有骨肉瘤和肺转移的患者在使用表达重组TCR的CD4+T细胞治疗后，有持续4个月的客观反应，重组TCR对癌－睾丸抗原黑色素瘤相关抗原A3（melanoma-associated antigen A3, MAGE-A3）有特异性。
免疫检查点抑制剂和其他免疫疗法的失败可能与骨肉瘤微环境的特性有关，这些特性不利于T细胞浸润，包括血管异常和肿瘤相关巨噬细胞的改变。优化肿瘤微环境以增强抗肿瘤免疫细胞浸润的干预可能增强上述免疫疗法的活性。
另一种潜在的免疫疗法是使用针对肿瘤特异性表面分子的抗体-药物偶联物。一项2期研究正在评估复发性骨肉瘤患者中曲妥珠单抗-deruxtecan（一种包含曲妥珠单抗和拓扑异构酶I抑制剂的抗体-药物偶联物）的疗效。在小鼠异种移植模型中靶向细胞表面蛋白LRRC15（通常由包括骨肉瘤在内的肉瘤表达）的抗体-药物偶联物的临床前研究也显示了对骨肉瘤的疗效。
发展之路
高级骨肉瘤患者的治疗结果缺乏显著改善，这与许多其他实体瘤的治疗进展形成对比。这种差异的原因包括不能根据预后特征而不仅是转移或不转移对骨肉瘤进行分类，对肿瘤微环境在免疫治疗中的作用以及这些肿瘤的遗传复杂性缺乏了解，限制了新疗法的逻辑构建。确定新活性药物的另一个主要障碍是可供研究的患者数量少。这在一定程度上是由于目前局限性疾病患者的长期存活率为60%，使得能够安全地参与新疗法研究的患者数量远小于每年诊断的新病例数（约800例）。当有希望的药物被确定后，在所有新诊断的骨肉瘤患者中对其进行评估将需要大量的患者，以显示显著高于60%的总体生存率。针对这种罕见癌症患者的分子定义的亚组，需要对肿瘤分类采用精细的临床前方法，以及在有限的随访时间内寻求小亚组大效应的新试验设计（图3）。
然而，可以解决的一个重要因素是使用不适当的终点来确定有前途的新制剂。实体瘤疗效评估标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST）于2000年采用。这些标准包括治疗后获得的肿瘤测量值比基线值减少，客观反应需要肿瘤持续缩小。客观反应被用作总生存率的替代指标，这是一个需要更长时间随访的终点。产生类骨基质的骨肿瘤可能使放射测量肿瘤收缩变得困难。在一项回顾性研究中，有74名新诊断骨肉瘤患者在1986年至2011年间接受MAP化疗，两名放射科医生对充分的新辅助化疗周期前后获得的影像进行了盲法和独立审查。尽管5年总生存率和无进展生存率分别为77%和61%，但在所有患者中均未观察到符合RECIST定义的客观反应。
在以RECIST或世界卫生组织相关标准为主要终点的7项2期研究中，对无复发生存率的回顾性分析进一步显示了使用RECIST标准评估骨肉瘤患者治疗反应的问题。所有7项研究都未能达到这些终点。在基线检查时有可测量疾病的96名患者中，4个月时无复发生存率为12%，而在切除肿瘤（无可测量疾病）的42名患者中，12个月时无事件生存率为20%。作者提出复发性骨肉瘤治疗的2期研究使用4个月以上的无事件生存率作为可测量疾病患者的活动指标，使用12个月以上的无事件生存率作为完全切除患者的指标。这些标准为新疗法的评估提供了基准。
最后的想法
其中一位在近40年前接受治疗的骨肉瘤患者现在还活着，并拥有完整的生命。这名患者给我们带来了希望。几十年来，我们从这些年轻患者身上学到了什么？
首先，我们认识到，在严格的临床试验时代之前发展起来的MAP疗法在现代可能被认为是一种失败的疗法。第二，新的测序技术在骨肉瘤的宏观层面上显示出意想不到的基因混乱：染色体重复、染色体碎裂和kataegis。尽管通过基因扩增或细胞信号调节因子（如PTEN）的丢失，激活复发性、靶向性驱动通路可能会带来治疗机会，但其复杂性对罕见癌症的临床试验设计提出了挑战。尽管如此，MAP化疗的成功表明，存在共同点。化疗策略很可能将广泛的MAP式治疗方法与精准医学方法相结合。最后，我们了解到，目前可用的免疫疗法并没有唤醒对骨肉瘤的免疫反应，这是一个必须解决的问题。
骨肉瘤预后差使其治疗更具挑战性。什么样的临床试验方法将标志着治疗的下一个时代？采用基于无进展生存率的终点的新临床试验设计已经确定了至少两种潜在的活性药物：瑞戈非尼（regorafenib）和卡博替尼（cabozantinib）。现在的任务是研究具有基因组和免疫学特征的肿瘤患者的靶向新组合。一个例子是在肿瘤以PDGFRA和VEGFR2的局灶拷贝数增加为特征的患者中检测瑞戈非尼或卡博替尼。另一个例子是研究瑞戈非尼与血管破坏剂和免疫疗法的结合。基于可在临床环境中复制的可操作生物标记物，个性化治疗的新设计需要国际合作研究才能走向成功。
最后，在骨肉瘤患者的治疗中难以获得新的药物进行评估，阻碍了进展。2017年《儿科研究公平法案》的重新授权，其中纳入了《加速儿童治疗和公平法案》的研究，解决了这一瓶颈。自2020年8月18日起，如果FDA确定药物目标与儿童癌症的生长或进展相关，则提交给FDA的新药申请必须包括癌症儿童试验计划。这限制了制药公司避免对患有癌症的儿童进行药物评估的能力，并且已经为罕见的儿科癌症的检测提供了新的途径。我们相信，在骨肉瘤临床研究的转折点上，这些进展将使生存率持续提高。
参考文献：Paul S. Meltzer and Lee J. Helman. New horizons in the treatment of osteosarcoma[J]. New England Journal of Medicine,2021,385:2066-2076.