20世纪80年代，出现了利用Watson-Crick的碱基配对规则来设计新药的概念，而随着对RNA调节基因表达和RNA剪接在健康和疾病中作用的不断认识，使得这种理念在今天变得比以往更具吸引力。在过去几十年里，靶向RNA的寡核苷酸技术逐渐成熟，利用基因组信息来设计药物已经成为了可能。
目前，像脊髓性肌萎缩症和高脂血症这样与众不同的疾病可以用一类作用于RNA的药物来治疗了，这就是新型药物——寡核苷酸（oligonucleotides），它利用Watson和Crick发现的碱基配对法则靶向与疾病相关的RNA。利用人类基因组测序的信息，完全基于基因组信息设计治疗性寡核苷酸是可行的，它将改变任何蛋白质的表达，甚至是那些对传统小分子药物无反应的蛋白。
尽管早在1978年就出现了用合成寡核苷酸调节RNA功能的概念，但要想在美国食品药品管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准的药物中实践这一理念，还需要基因组学、化学、药理学和药物递送方面的不断进步。目前，数十种旨在治疗血友病、淀粉样变性、止血和高脂血症等多种疾病的寡核苷酸正在开展临床试验，Arthur A. Levin博士最近在《新英格兰医学杂志》上撰文介绍了4种不同的靶向RNA的寡核苷酸，以及治疗性寡核苷酸领域的新方向。
一、作用机制
治疗性寡核苷酸的长度通常为15至30个核苷酸，并且被设计为与编码疾病相关蛋白的信使RNA（messenger RNA, mRNA）或调节性RNA的特定区域互补。肠胃外给药后，寡核苷酸进入细胞并与互补RNA结合。在设计治疗候选物时，目标是找到与靶RNA高度特异性结合的序列，避免与非靶的同源RNA杂交的序列。在生物信息学的引导下，经过精心设计的特定序列可以在密切相关的基因家族中，选择性地靶向单个成员。
一旦寡核苷酸药物与其互补mRNA或mRNA前体结合，就会引发一系列事件，最后的结果部分取决于靶序列的性质，比如：通过酶解作用破坏mRNA（当突变mRNA编码致病蛋白时，这很有用），或者改变mRNA前体的剪接模式（当错误剪接模式产生致病产物时，可以这样治疗），或者改变调节性RNA的功能。选择哪种方式取决于疾病机制，以及是要获得RNA功能，还是要去掉其功能。
目前获批的寡核苷酸药物包括了2种机制：诱导目标mRNA的裂解；或改变mRNA前体的剪接模式。诱导分裂的寡核苷酸能够将内源性的酶招募到药物杂交的靶mRNA上。改变剪接的寡核苷酸在靠近剪接控制位点的部位与mRNA前体杂交，通过空间位阻作用，改变酶对mRNA前体的作用。
二、治疗机制
剪接引起功能变化
人类基因组中只有小部分遗传信息被翻译成蛋白质。例如，编码肌营养不良蛋白的DNA分散在一个有240万碱基对的区域，但肌营养不良蛋白mRNA由大约1.4万个碱基组成。剪接和编辑mRNA前体的过程是遗传调控的一个方面。可以通过选择性剪接来编辑mRNA前体以产生不同的蛋白质同源异构体，其可以有不同的功能，有时甚至是相反的。可变剪接在人类健康和疾病中的作用正在越来越广泛地被认识到，并且调节或改变剪接过程的机制可以被用于治疗。
外显子跳跃与杜氏肌营养不良
杜氏肌营养不良（Duchenne＇s muscular dystrophy，DMD）是一种由DMD基因突变引起的致命疾病，DMD是一种编码肌营养不良蛋白的基因。79个外显子中的任何一个发生移码突变（frameshift mutations）都会产生不稳定或无功能的蛋白，导致杜氏肌营养不良。无法产生肌营养不良蛋白导致细胞骨架元件与肌纤维膜断开。罹患这种疾病的患者，肌肉收缩会导致肌膜微撕裂、细胞损伤、细胞死亡，最终导致肌肉功能丧失。
Eteplirsen是一种经FDA批准的寡核苷酸药物，它可以诱导剪接时跳过外显子51。Eteplirsen通过与发生了移码突变的51号外显子内的一个位点杂交，从而在空间上阻止剪接体与之结合，迫使其“跳过”该外显子来纠正移码突变。于是，52号外显子被剪接到了50号外显子上，这样一来，读码框内更远端的下游外显子就能够通过细胞翻译机制被读取，产生一种“缩短版”但仍保有功能的肌营养不良蛋白。
外显子跳读的疗法在贝氏肌营养不良（Becker’s muscular dystrophy）患者的自然病程中得到了印证，这类患者的DMD核心外显子发生了整码突变（in-frame mutation），导致肌营养不良蛋白出现了缩短，但仍有功能，这类患者肌营养不良的表型也较为温和。使用Eteplirsen等诱导外显子跳读的药物，其治疗目标是跳过外显子51，将DMD外显子的毁灭性突变转化为整码敲除，从而模拟一种更温和的表型(类似于贝氏肌营养不良)。大约13％的肌营养不良症男性患者可以通过51号外显子跳读来治疗。针对其他不太常见的外显子突变的药物正在研发中，但要设计出能够在较小的患者亚群中显示出统计差异的临床试验，即使是可行的也将极为困难。而且，如何证明治疗收益也是个巨大挑战。
每周静脉注射Eteplirsen治疗外显子51相关的杜氏肌营养不良患者，会令DMD编码的短mRNA和肌营养不良蛋白的表达略有增加。与对照组相比，接受治疗的患者6分钟步行距离得到了一些改善。尽管Eteplirsen组肌营养不良蛋白的恢复程度有限、试验规模较小、对结果的影响也不大，但FDA还是批准了Eteplirsen，并要求其在随后的临床试验中增加剂量和患者数量。Eteplirsen活性较弱的一个原因是，大部分药物通过肾小球滤过迅速排出，而剩下的只有一小部分被骨骼肌吸收。事实的确如此，全身给药后如何在体内传递到靶部位一直是寡核苷酸药物开发中的关键挑战。
脊髓性肌萎缩症中的外显子纳入
脊髓性肌萎缩症（spinal muscle atrophy，SMA）是一种常染色体隐性遗传病，由SMN1基因突变引起，导致SMN1蛋白功能丧失。SMA表现为肌肉无力，受影响最严重的婴儿无法控制头部。随着腹角中运动神经元的退化，呼吸功能逐渐丧失，最终患者死亡。
SMN2是种天然存在的旁系同源基因（即，它与SMN1共享“共同祖先”基因），如果不是外显子7中的单核苷酸改变导致该外显子被跳过，其编码区与SMN1的编码区就是相同的。SMN2编码的蛋白没有外显子7编码的部分，它只能短暂存在便快速降解，因此并无功能。然而，部分SMN2 mRNA被翻译成了SMN蛋白。再加上可能存在多个SMN2拷贝这一事实，而每个拷贝都将影响SMN水平，这解释了SMA严重程度的多变性。
如果能利用寡核苷酸诱导外显子7的表达，增加SMN2向功能蛋白翻译的比例，就可以产生足够的功能SMN蛋白来拯救神经元的功能。通过合成内含子3′区到外显子7的反义序列，研究人员找到了一种寡核苷酸——nusinersen，它可以有效地将外显子7也纳入转录翻译。当nusinersen与目标位点杂交时，就会阻止剪接信号把外显子7剪除。最后的结果是，mRNA中包含有原本缺失的SMN2外显子7。SMN2编码的SMN蛋白现在功能齐全，可以作为缺失SMN的替代品，SMA患者由此得到了治疗。
Nusinersen治疗可产生功能性SMN蛋白，拯救运动神经元，使神经元发育得更正常。在成功的临床试验中，治疗的第一个月使用4次负荷剂量，此后每4个月使用一次维持剂量，结果显示婴儿和较大儿童的运动功能有统计学上显著的提高。Nusinersen的这种用法于2016年底得到了FDA的批准。
基于裂解的机制破坏mRNA
有些寡核苷酸药物是通过裂解机制来降低疾病相关mRNA及其蛋白产物水平的，目前已被FDA批准的药物有3种，其他的尚在临床试验中。Mipomersen和Inclisiran这两种药物用不同的裂解机制来改变胆固醇的分布。这两种药物各自针对不同的基因产物，而这些产物在高胆固醇血症中都很重要，表明了寡核苷酸治疗药物功能的多样性。每种机制共同的一点是激活内源酶，从而导致目标mRNA在与寡核苷酸药物的杂交位点发生裂解。
Mipomersen是一种单链寡核苷酸，其序列与编码载脂蛋白B的RNA部分序列互补，载脂蛋白B是产生于肝脏的低密度脂蛋白(low-density lipoprotein, LDL)胆固醇的组成部分。对长度为20 mer的寡核苷酸进行化学修饰以增加其对RNA的亲和力及稳定性。Mipomersen的核心序列有类似DNA的性质，当Mipomersen与载脂蛋白B的前体mRNA杂交时，DNA-RNA异源双链的存在吸引并激活了核糖核酸酶RNase H，从而使mRNA发生裂解。这一裂解过程使载脂蛋白B mRNA失活，从而减少了载脂蛋白B的产生。结果，肝脏输出的极低密度脂蛋白胆固醇得以减少，最终，循环中的LDL胆固醇降低，即使在他汀类药物治疗无效的患者中也是如此。FDA于2013年批准Mipomersen用于高胆固醇血症纯合患者的治疗。
Inclisiran是一种实验性治疗剂，诱导编码前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶-Kexin 9型（proprotein convertase subtilisin–kexin type 9，PCSK9）的mRNA的裂解，PCSK9是负调节LDL受体（LDL receptor，LDLR）水平的酶。天然携带能令PCSK9活性降低的基因变体的人，拥有比其他人更高的LDLR水平、更低的LDL胆固醇水平和更低的心血管风险。Inclisiran靶向PCSK9 mRNA，使其裂解、失活，从而降低PCSK9的水平，提高LDLR水平及LDL胆固醇的清除率，降低LDL胆固醇的循环水平。Inclisiran正在进行后期临床试验。
三、寡核苷酸的优点
理论上来说，以寡核苷酸为基础的治疗，其优势在于只需要找到与疾病过程相关的RNA，确定目标区域，候选药物就能呼之欲出。然而，RNA具有二级和三级结构，并且经常与蛋白质结合。因此，并不是每一个完全匹配的寡核苷酸都能与目标RNA上的互补序列结合。因此，在实际应用中，经常会从与目标RNA完全匹配的序列文库中进行筛选。
合成完全匹配序列文库的简单性使得找到活性寡核苷酸药物的过程要比小分子药物快。可在数周内确定活性药效基团，并迅速生产相关药物。相比之下，小分子药物的发现往往需要多年对结构和活性之间关系的反复研究。与药物发现过程一样，不同寡核苷酸药物的发展过程(包括毒理学研究、药代动力学分析，以及生产制造)高度相似，这也提高了效率。
四、寡核苷酸药物治疗的挑战
与医学中的其他新技术的发展类似，比如单克隆抗体和基因疗法，基于寡核苷酸的治疗在成熟期间也克服了诸多挑战。与化学和制造有关的挑战已经得到解决。合成寡核苷酸前体降低了制造成本，对寡核苷酸的化学修饰提高了其对核酸酶代谢的抵抗，产生了更有利的药代动力学特征。
尽管取得了相当大的进展，但要想广泛应用寡核苷酸疗法，还存在两大障碍：药物安全性与药物递送。寡核苷酸可以通过与Toll样受体（toll-like receptors, TLRs）的相互作用，激活固有免疫。一些寡核苷酸与TLR结合后，诱导出了类似于由病毒和细菌RNA和DNA诱导的免疫应答。
单链硫代磷酸寡核苷酸的促炎特性让一些早期的治疗项目遇到了绊脚石，因为经常在皮下注射反义药物后观察到注射部位的反应，包括Mipomersen和候选药物Drisapersen都是如此。而且，高剂量的硫代磷酸寡核苷酸还与全身症状的出现有关，如发热、寒战。此外，一些单链硫代磷酸寡核苷酸的序列还会诱发低滴度的抗药抗体。
单链硫代磷酸寡核苷酸的其他问题还有肾脏蓄积和罕见但显著的血小板计数降低。在用某些硫代磷酸寡核苷酸治疗后，一些患者出现轻度的低分子量蛋白尿，有些时候还会发生肾小球肾炎。在临床试验中，至少有三种硫代磷酸寡核苷酸在患者中产生了明显的血小板减少。
药物递送仍然是广泛应用寡核苷酸治疗的最大挑战之一。由于寡核苷酸药物的分子量在5 kDa到15 kDa之间，而且本质上是亲水的，穿透细胞膜的能力受限，因此它们进入细胞质或核内与活性位点结合的机会不高。
除了肝脏外，这类药物递送到大多数器官和组织都是具有挑战性的。在静脉或皮下给药后，脂质纳米颗粒中的寡核苷酸和siRNAs主要被非实质细胞吸收，一小部分则被肝细胞摄取。
聚合纳米颗粒已经被用来运送寡核苷酸，但是肝脏对血浆纳米颗粒的清除使得其运送到其他组织和器官变得很困难。在自然界中，细胞间的遗传信息传递是由膜结合的纳米囊泡或外泌体介导的，它们从某些类型的细胞中萌发。随着不断增长的有关循环中外泌体、及其膜组成和膜相关蛋白的信息，必将带来更好的药物递送系统。
五、未来发展方向
目前，靶向RNA的治疗领域主要由通过裂解机制和剪接调控发挥作用的寡核苷酸所主导。当然，其他基于RNA机制的尝试也正在进行中。
20世纪80年代，出现了利用Watson-Crick的碱基配对规则来设计新药的概念，而随着对RNA调节基因表达和RNA剪接在健康和疾病中作用的不断认识，使得这种理念在今天变得比以往更具吸引力。在过去几十年里，靶向RNA的寡核苷酸技术逐渐成熟，利用基因组信息来设计药物已经成为了可能。
（编译：贾盛崧）
参考文献：New England Journal of Medicine 2019;380:57-70