类器官是干细胞在体外生长构建的具有3D结构的微器官，模拟其体内对应器官的许多结构和功能特征。借助类器官这项技术，已经建立了多种人类癌症的新模型。现在，可以从患癌个体的肿瘤组织出发，建立多种类器官，覆盖一系列癌症。而且，利用CRISPR基因编辑技术，可将癌基因引入正常类器官，来设计癌症的类器官模型。如果再结合免疫细胞和成纤维细胞，就可以让肿瘤类器官变成癌症微环境的模型，可应用于免疫肿瘤学领域。越来越多的证据表明，类器官可准确预测个性化治疗中的药物反应。在这里，我们将回顾肿瘤类器官领域快速发展的当前状态和未来前景。
三十多年来，Mina Bissell一直致力于在三维（three-dimensional, 3D）基质中培养功能性人乳腺上皮细胞。大约十年前，Sasai及其同事开创了基于多能干细胞(pluripotent stem cell, PSC)的技术，并构建出模拟一部分中枢神经系统（central nervous system, CNS）的类器官（organoids）。Lancaster及其同事改进了这项技术，并提出了著名的“迷你脑”结构。
虽然PSCs足以构建所有从组织到器官的发育过程，但人们同时也建立了基于成体干细胞(adult stem cells, ASCs)的技术，以生成它们所在组织的类器官模型。特定的生长因子“鸡尾酒”可以通过模拟器官干细胞龛使得ASC类器官长期生长，这项技术最早是用于构建小鼠和人类肠道和气道上皮细胞。由PSCs和ASCs产生的类器官，反映了组织整体结构、分化细胞类型和组织特异性功能方面的关键特征。因此，类器官代表了可以与传统的基因工程小鼠模型（genetically engineered mouse models, GEMMs）、细胞系和人源异种移植物（patient-derived xenografts, PDXs）进行比较的模型系统（表1）。
除了用于研究正常发育，类器官也用于研究肿瘤的发生。如，CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）编辑技术已应用于基于PSC技术的类器官，以产生致癌突变，模拟人类的脑肿瘤等。此外，Fine及其同事还探索了PSC衍生的迷你脑作为胶质母细胞瘤细胞生长的环境。
无血清3D基质中，R-spondin-1、表皮生长因子(epidermal growth factor , EGF)与骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)抑制剂的混合物，支持小鼠隐窝干细胞作为3D肠上皮结构的无限扩增。人体肠道类器官需要还额外的成分：Wnt、转化生长因子-β(transforming growth factor-β, TGF-β)抑制剂和p38抑制剂。这种生长因子“鸡尾酒”混合物，同样支持患者来源的结直肠癌(colorectal cancers, CRCs)类器官的增殖。一些小的修饰还让其他上皮组织（如胰腺和前列腺）及其癌细胞得以扩增，从而创造了“活的生物库”。
目前广泛应用的两种检测患者样本药物敏感性的方法，是肿瘤切片的短期培养和肿瘤在免疫缺陷小鼠体内的异种移植物（如：PDXs）。短期培养可以快速进行体外筛选，但受限于培养物增殖能力有限；异种移植物可以在体内进行筛选，但速度缓慢且成本高昂。肿瘤类器官则可以将这两种方法联系起来。初步研究表明，对人源类器官(patient-derived organoids, PDOs)进行中等剂量药物筛选是可行的。而且肿瘤类器官很容易移植到免疫缺陷小鼠体内，在PDX环境中可以得到对PDOs体外观察结果的确认。
构建肿瘤类器官生物库
国际癌症基因组联盟(International Cancer Genome Consortium)和癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas)等分析的绝大多数样本，代表的是原发性肿瘤的手术样本，而转移通常代表的是癌症的致死阶段。从理论上讲，PDOs允许扩增肿瘤样本，从而可以在任何阶段分析癌症。事实上已有几项研究报道，从肝癌、胰腺癌或结直肠癌的肝转移穿刺物中提取的组织可以构建类器官。Gao等人已经证明用前列腺癌患者的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTC）培养类器官的可行性。PDO生物库扩展了可以在实验室中繁殖和研究的患者样本类型。
可以说，PDOs至少在肿瘤DNA序列水平上反映了原发肿瘤的特征。然而，类器官是否存在瘤内异质性尚不清楚。另一个未解决的是“块状”有机体在长期培养过程中的克隆漂移。至少对于一些CRC和卵巢癌的PDOs研究来说，这种克隆漂移似乎相对较小。从CRC获得的单个细胞和相邻的正常细胞所建立的PDOs，对其进行的分子和功能分析表明，CRC细胞表现出广泛的突变多样性，携带的体细胞突变高于正常干细胞数倍。大多数突变是由新的突变过程引起的。每个肿瘤中DNA甲基化和转录状态的多样性是稳定的，并遵循该肿瘤中DNA突变的系统发育树。然而，同一肿瘤的细胞之间，抗癌药物反应显著不同。
类器官：培养皿中模拟癌症进展
由于Fearon和Vogelstein提出腺瘤到癌的进展是一系列特定致癌突变的有序结果，CRC已经成为癌症进展的典型范例。类器官通常可以从正常的人类上皮细胞中提取出来，允许在体外对所有恶性肿瘤阶段进行突变建模(图1)。Sato及其同事证实了在体外培养各种类型的癌前结肠瘤的可行性。两项使用CRISPR技术的独立研究，从健康的野生型人结肠类器官开始，逐步重建腺瘤到癌的进展。
Meltzer及其同事从Barrett食管患者活组织切片中获得了类器官。为了记录APC在Barrett食管恶性转化中的作用，采用CRISPR基因组编辑技术构建了APC敲除(APC knock-out, APCKO)类器官。APCKO类器官显示了较高的增殖和复制活性。另一项研究使用CRISPR编辑为锯齿状CRC创建了一个类器官模型，锯齿状CRC是一种与BRAF突变激活相关的亚型。将活化的BrafV600E突变导入正常结肠类器官，并在其他几个基因位点引入失活突变后，产生了锯齿状腺癌。
通过CRISPR基因编辑，可以实现肠道类器官的亚克隆，从而对肿瘤基因功能进行详细的研究。利用CRISPR删除关键的DNA修复基因， DNA修复缺陷会产生特定的突变特征。这些特征可以与已知的癌症相关特征进行比较。实际上，错配修复基因MLH1缺陷的类器官中的突变积累模拟了错配修复缺陷的CRCs的突变谱。编码一种碱基切除修复蛋白的癌症易感基因NTHL1突变，揭示了先前在一名乳腺癌患者身上观察到的突变特征，随后发现该患者携带生殖系NTHL1突变。此外，在不具有Ras通路突变的CRC类器官系中引入活化KRAS突变，可以揭示KRAS突变对药物反应的影响。
小鼠干细胞研究的一个主要进展是干细胞标记基因敲入（gene knock-in；是通过同源重组用一种基因替换另一种基因，以便在体内测定它们是否具有相同的功能，或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的），使标记阳性（+）细胞的可视化、选择性杀伤和谱系追踪成为可能。依据类似的方法，Sato及其同事将Lgr5等位基因敲入人结肠癌类器官，然后进行异种移植，谱系追踪实验揭示人LGR5+细胞在异种移植的CRC类器官中的自我更新和分化能力。使用LGR5-icaspase9敲入等位基因选择性消融LGR5+肿瘤细胞，可导致短暂的肿瘤消退。De Sauvage及同事用小鼠类器官开展了类似实验，他们指出Lgr5细胞消融导致原发性肿瘤的停滞，而Lgr5+细胞对肝转移至关重要。
目前基于ASC的类器官技术不支持正常CNS组织的生长，但PSC衍生的类器官填补了这一空白。通过引入致癌突变，PSC衍生的CNS细胞质再现了脑肿瘤的发生过程，有助于定义导致胶质母细胞瘤样肿瘤和原始神经外胚层瘤样肿瘤的特定突变组合。这些类器官是可异种移植的，并且易于药物筛选。
因此，CRISPR和人体类器官技术的结合产生了一个多能工具箱，用于逐步构建人类癌症模型，从而构建一系列恶性肿瘤的同基因组类器官。它们类似于GEMMs，并且类器官工程可以加速产生额外的GEMMs以及人类癌症移植模型。
类器官共培养，模拟肿瘤微环境
肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)影响着肿瘤的发展和治疗反应，但由于其在组织培养和体外操作中难以维持，因此很难对其进行构建模拟。肿瘤类器官模型一般缺乏完整的微环境。然而最近的研究表明，与TME细胞的类器官共培养提供了一种新的方法来在某些方面模拟TME。例如，胰腺星状细胞(一种驻留间充质的细胞群)与胰腺癌PDOs共培养会产生典型的胰腺癌间质，并产生肿瘤相关成纤维细胞(cancer-associated fibroblasts, CAF) ，它们能分泌白介素6（interleukin-6, IL-6）来促进类器官增殖。
免疫细胞是另一种常见的TME细胞类型，PDO共培养在评估癌症相关免疫细胞方面已显示出前景。例如，Kuo和同事用气液界面（air-liquid interface, ALI）培养基对传统ASC类器官进行了改进，使用这种方法，具有免疫和成纤维成分的PDO可以由原发肿瘤碎片繁殖数周得到，这些ALI培养物显示出T细胞克隆多样性，反映了患者外周血中的T细胞多样性。ALI培养物已用于分析多种人类肿瘤（包括黑色素瘤、肺癌和肾细胞癌）的免疫检查点治疗。
类器官培养在个体化医疗中的应用
类器官研究的一个重要目标，是它们是否可以代表个体癌症。迄今为止，来源于多种人类肿瘤的类器官对传统药物和在研药物表现出了一系列反应(图2)。对有限患者进行的回顾性分析表明，PDOs对治疗的反应在很大程度上与这些患者对相同药物的最初反应相似。PDO还提供了开发克服先天或获得性耐药药物的模型，已证明在评估DNA修复途径和卵巢癌PDOs复制叉稳定性时尤为重要。重要的是，PDO对细胞毒性药物的相对敏感性（与许多靶向药物相比，在体内具有较窄的治疗指数）可能还反映了患者对这些药物的临床反应。
PDOs除了具有帮助个别患者选择治疗方案的潜力外，代表一种癌症的大型PDOs已用于开发可预测大量患者药物反应的生物标志物。最近使用66个胰腺癌PDOs样本进行的一项研究，比较了标准细胞毒性药物对这些PDOs基因的影响，从而得出了不同化学疗法下的转录特征。尽管尚不清楚基因表达特征是否反映了药物药理学或药物反应的差异，但当将其应用于独立的一组患者样品时，该特征可以正确地识别出一大批对该疗法有所改善的患者。
为了将PDO开发为可前瞻性指导癌症患者治疗的临床测试，未来应设计初始临床研究，以衡量PDO对大量接受相同药物治疗的患者的敏感性和特异性。与此同时，其他可能预测治疗反应的生物标志物也可以以类似的方式进行评估，如化疗敏感性基因表达特征。目前，PDOs可用于选择二线或辅助治疗，因为培养和检测PDO所需的时间约为4周~6周。将PDO开发和药物测试缩短到一周需要创新，但也将使PDO能够作为癌症患者的一种前瞻性测试。
类器官研究面临的挑战
改善类器官模型面临几个挑战，包括更具代表性的癌症模型的建立(图3)、提高当前模型中类器官的生长效率并缩短类器官的培养时间、降低类器官培养成本，以及开发进行高通量药物和免疫治疗筛选的方法(表1)。除了免疫细胞和成纤维细胞外，还包括血管和神经等TME因素，这将为类器官模型开辟新的研究方向。随着类器官模型越来越复杂，肿瘤细胞固有的基因组和表观基因组异质性成为重要的考虑因素，因为这些是人类癌症的特性，决定了肿瘤的行为和对治疗的反应。
展望
通过建立类器官并模拟TME，人类癌症发展的所有阶段（包括正常细胞、浸润前癌、浸润性癌细胞和转移性细胞）都可以在实验室进行研究，并储存在生物库中供全球使用。这些细胞可用于癌症生物学的研究，这毫无疑问将成为基础发现的来源。例如，在某些早期人类癌症中，PDOs可用于识别分子畸变，作为生物标记物和治疗靶点。此外，在药物开发的早期，PDOs显示出良好的前景，涉及类器官的临床试验应该被设计来确定类器官是否准确地模拟了病人的癌症，从而预测他们对治疗的反应。类器官作为对其他传统癌症模型的补充，在癌症生物学和医学中当考虑该使用哪种模型时，应该权衡每种模型系统的优缺点(表1)。类器官模型处于迅速发展阶段，尽管目前面临的挑战需要解决，但这种方法将对基础癌症研究和临床医学发展产生积极影响，前景可期。
（编译：贾盛崧）
参考文献：Science 2019;364:952-95