改造肉毒杆菌神经毒素，以识别不同底物。

肉毒杆菌神经毒素是已知的毒性最强的物质。这种毒素家族中最著名的成员是肉毒杆菌神经毒素A1，也就是众所周知的肉毒素（Botox，保妥适），医美里的瘦脸针。

肉毒杆菌神经毒素是一种针对神经元的大蛋白质，它会阻碍神经突触囊泡的释放，从而导致瘫痪。尽管肉毒杆菌神经毒素具有极高的毒性，但它仍被用于治疗与美容。由于缺乏工具来掌握这些毒素蛋白酶结构域复杂的底物特异性，将它们的潜力扩展到天然底物之外受到了限制。最近，哈佛与麻省理工学院Broad研究所的Blum等描述了一种噬菌体辅助进化方法来控制毒素蛋白酶结构域的底物特异性。这可能会给以前无法治疗的疾病带来新的治疗方法。

肉毒杆菌神经毒素会导致致命的肉毒素中毒，这通常与食用不好的罐装食品有关。这种疾病也可由寄生在婴儿肠道的肉毒梭菌释放出的毒素引起。尽管肉毒杆菌毒素是已知的毒性最强的化合物之一，每公斤体重中位致死剂量只有几纳克，但它仍被用于治疗，主要用于抑制特定的肌肉。神经毒素应用的数量正在迅速增加，目前有100多种医疗条件适用这种毒素。

这种毒素有着精巧的设计，包含三个域，每个域有不同的任务。结合域（binding domain）指导毒素找到正确的细胞——这种神经元上有结合受体，转运结构域将跨膜蛋白酶转入细胞。肉毒神经毒素的矛头是轻链蛋白酶域,它能分解神经元中各种可溶性NSF附着蛋白质受体(soluble NSF attachment protein receptor，SNARE)。蛋白酶结构域通过广泛的相互作用和几个外部位点(毒素上的次级底物结合位点)识别其SNARE底物，完美地解释了底物高特异性。

SNARE蛋白在膜-囊泡融合中起关键作用。SNARE蛋白的裂解终止了释放突触囊泡所需的囊泡融合事件，神经肌肉连接点处包含神经递质乙酰胆碱的囊泡无法释放，切断了神经肌肉之间的连接。

为了掌握毒素蛋白酶结构域的底物特异性，Blum等开发了一种噬菌体辅助连续进化的变种，可同时促进特异性蛋白酶活性的阴性和阳性选择。简单地说，该技术依赖于将蛋白酶结构域的预期特性与噬菌体的感染性相结合，并允许噬菌体在许多代中快速进化。

降低特异性从而扩大酶的底物特异性已被证实。然而，Blum等所描述的方法的巧妙之处在于可以在选择某种底物的同时选择另一种底物。作者通过改造X型肉毒杆菌神经毒素(一种最近发现的具有多种天然底物的肉毒杆菌神经毒素)证明了这一点。Blum等设计了这种毒素，使其能够有效地裂解其中的一种底物，而对其他底物没有活性。另一项关键进展是能够让毒素进化出对全新底物的活性，正如他们通过将肉毒杆菌神经毒素E改造为非SNARE靶向所显示的那样。

Blum等开发的方法在许多领域都具有巨大的潜力。毒素的蛋白酶结构域可以改造成裂解与痛感有关的特定蛋白质。或者，我们也可以设想，改造毒素使其在保留原癌基因的同时，向突变的癌基因发起进攻，以癌细胞为目标，同时保留其他细胞。还有许多其他蛋白酶，改造其底物的特异性可能有很大的潜力。例如，Blum等的技术可用于改善和改变其他蛋白酶的特异性，这些蛋白酶正在开发用于治疗心血管疾病、消化系统疾病、炎症、囊性纤维化、视网膜疾病和其他医疗情况。该方法也可用于开发高度特异的蛋白酶，以作为研究工具，类似于肉毒杆菌神经毒素用于囊泡融合的研究。

在我们能够充分利用肉毒杆菌神经毒素和其他蛋白酶的潜力之前，还有许多挑战。Blum等的发现开辟了新的研究领域，有可能针对以前无法可医的疾病开发新的治疗方法。

参考文献：Travis R, Blum, LIU Hao, Michael S, Packer, et al. Phage-assisted evolution of botulinum neurotoxin proteases with reprogrammed specificity [J]. Science, 2021,371(6531):803-810