季节性流感疫苗对大流行性流感菌株缺乏有效性。开发更广谱免疫的改良疫苗仍然是公共卫生的优先事项。目前疫苗的免疫反应主要集中在血凝素头部结构域，而下一代疫苗针对的病毒结构改变不大，比如血凝素茎部结构。提高疫苗效力的策略包括：使用基于结构的设计和纳米颗粒来优化目标抗原的抗原性和免疫原性；增加抗原剂量；使用新型佐剂；刺激细胞免疫；以及靶向其他病毒蛋白，包括神经氨酸酶、基质蛋白2或核蛋白。对流感病毒抗原结构和免疫生物学的深入了解正在推动新型疫苗的发展。
接种疫苗是控制流感流行和维护公众健康的一种有效且经济的方法。季节性流感疫苗自20世纪40年代问世以来，挽救了无数人的生命，限制了大流行的传播。尽管如此，流感病毒仍然通过基因突变、逃避天然免疫而继续进化，疫苗必须每年更新。目前已上市疫苗的保护效力每年都有所不同（图1a），这取决于流行病毒和疫苗株之间的抗原匹配。宿主的免疫状态也会影响疫苗的效力。例如，年轻人和老年人更容易出现流感并发症。
在过去的100年里，新型流感病毒曾几次导致大流行，而旧的大流行病毒也可能在将来卷土重来，这凸显了持久和广泛保护性流感疫苗的必要性。欣慰的是，免疫学和病毒学的进展，加上结构生物学和生物信息学提供的信息，正在促进新疫苗的开发。
目前已获许可的流感疫苗一般是灭活或减毒活疫苗。大多数灭活疫苗由病毒裂解或流感亚单位抗原组成（表1）。病毒裂解疫苗是通过用化学物质或洗涤剂破坏病毒颗粒而生产的，由于制造方便，因此得到广泛应用。亚单位疫苗含有病毒血凝素（haemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）蛋白质，这些蛋白质在化学或洗涤剂裂解后得到部分纯化。流感减毒活疫苗是由适应寒冷的病毒制成的，在体温下不能很好地复制，它是鼻内应用的。这种类型的疫苗可诱导强烈的局部黏膜免疫，但仅推荐2岁至49岁的非怀孕个体。
三价疫苗含有来自两种甲型流感病毒株和一种乙型流感病毒株的病毒成分，而四价疫苗则额外添加了另一种乙型流感病毒。病毒培养一般在鸡胚中进行，因此生产很大程度上依赖于稳定的鸡蛋供应。对病毒蛋白的任何修饰都不能损害流感病毒的复制，这限制了可以被纳入疫苗的修饰蛋白的种类。利用细胞培养病毒的新技术已经开发出来，但所选疫苗株仍需适应细胞生长，而且制造成本仍然很高。最近，一种由昆虫细胞生产的重组HA亚单位疫苗在健康成年人身上显示出有效性，并在老年人中提高了保护效果。
疫苗设计的创新方法已经在探索中，以开发“通用”流感疫苗。其目的是诱导对不同流感病毒的交叉免疫，并延长免疫反应的持续时间。
拓宽现有疫苗的广度
甲型流感病毒可以根据两种关键的病毒表面糖蛋白HA和NA进行抗原性分类，而乙型流感病毒形成一个具有两个不同谱系的单一抗原群，即B/Victoria/2/87样和B/Yamagata/16/88样谱系，共有18种不同的HA亚型（图1b）。
目前获得许可的流感疫苗含有三种（三价灭活疫苗）或四种（四价灭活疫苗）病毒株，预防季节性流行病，需要根据对流行毒株漂移的全球监测，每年为北半球和南半球重新配制疫苗。传统上，季节性疫苗诱导的血凝抑制（HAI）抗体滴度往往只适用于同源病毒株。HAI滴度与匹配流感病毒株的体外中和作用相关，使用该方法的早期研究表明，血清滴度为1:18~1:36可以保护50%的人类免于感染。季节性流感疫苗主要是通过鸡胚培养和生产，然后进行灭活，这是一个耗时和劳动密集的过程。这种方式可能会导致HA偶尔发生突变，从而影响免疫反应。最近的一份报告证实了这一发现，该报告比较了在鸡蛋中生长的病毒和哺乳动物细胞中生长的病毒，结果显示，在卵子适应过程中产生的突变可能会阻碍广泛中和抗体的产生。在开发下一代疫苗的同时，有多种努力正在改进这些现有的疫苗。
抗原剂量、方案及优化
尽管开发“真正的”通用流感疫苗仍然是一个具有挑战性的目标，但专家和政府机构已经提出了战略计划。比如通过扩大亚型、扩大保护范围，有些疫苗已经显示了渐进的、递增的疗效。例如，高剂量四价灭活疫苗比标准剂量疫苗更有效地减少与流感感染相关的临床结果，现在建议在健康老年人中常规使用，显示出了更高效的季节性疫苗的益处（图1c，毒株特异性）。在老年人中，重组蛋白疫苗（flublock）和佐剂疫苗（Fluad）也能增强对流感样疾病的保护，这可能增加了不同亚型的覆盖率（图1c，亚型特异性）。在动物模型中，合理选择的H1-HA免疫原的组合被用于诱导广泛有效的抗体反应，包括一种多价疫苗候选物，它诱导抗体中和不同的H1N1病毒，提供更广泛的H1或亚型特异性覆盖（图1c，亚型特异性）。另一种产生更广泛的s亚型特异性免疫应答的方法是使用计算算法设计“共识”序列。在临床前研究中，一种被称为“计算优化，广泛反应性抗原”（COBRA）的抗原在亚型（如H1、H3或H5）中诱导一些交叉反应性抗体。另一种信息学方法提供流感病毒序列的计算分析和人工合成HA抗原的电子设计。将这种“嵌合”HA抗原以改良的痘苗病毒安卡拉（MVA）载体传递，可对多种流感病毒提供保护。这些研究表明，开发一种超季节性疫苗是可行的，它可以覆盖每个循环亚型中的多个毒株，从而防止流感病毒株变异。
覆盖范围可进一步扩大，以包括第1组或第2组HA中的不同亚型（图1c，多种亚型），特别是具有大流行潜力的亚型，如H2N2、H5N1和H7N9。例如，在小鼠和雪貂模型中，接种DNA引物后再接种季节性流感疫苗，不仅能提高HA抗体反应，而且还能诱导对不同H1N1和H5N1的保护性免疫。针对所有HA抗原中共同病毒结构的新型免疫原也已设计和评估，并且已分离出与第1组、第2组或乙型流感病毒中所有HA抗原有广泛反应的抗体，进一步为研制覆盖大多数甲型流感和乙型流感病毒株的疫苗铺平了道路（图1c，泛谱系、甲型流感、甲型和乙型流感）。
然而，真正的通用疫苗应能抵御所有流感病毒株，并且应能维持数年（图1c，“真正的”通用疫苗）。
给药和使用
近年来，包括减毒活疫苗、病毒载体、信使核糖核酸技术和纳米技术在内的给药方法的进展，在诱导更多的交叉免疫方面显示出了希望。一种典型的重组乙型流感病毒疫苗，将病毒PB1和PB2基因的突变结合在一起，产生了一种稳定的减毒病毒，可以抵御致命的异源流感病毒攻击。有复制缺陷的载体，如MVA、腺病毒、纽卡斯尔病病毒和α病毒，可以表达各种流感抗原，并用于prime-boost方案中，在获得同源和异源免疫方面显示出一定程度的成功。病毒样颗粒流感疫苗也已在各种临床试验中进行了评估，有些疫苗已引起长期免疫，并诱导对异源菌株的交叉反应性HAI反应。重组蛋白疫苗由来自保守病毒结构的肽组成，改良活流感病毒也正在后期临床试验中进行评估。流感病毒HA也被合理地设计成以细菌为基础的铁蛋白纳米粒子。这些颗粒使HA在有序排列的同时保留其天然的三聚体构象，增加价态，从而促进B细胞受体的交叉连接。在动物模型中，这种纳米颗粒疫苗改善了HA抗体的反应，并对异种病毒攻击提供了保护，目前正在进行1期临床试验（表2）。
新型HA疫苗
季节性疫苗制造商通过测量和标准化疫苗中每种HA成分的数量来确定其疫苗产品的特性。结构生物学的最新进展，包括晶体学、电子显微镜和生物信息学，使人们对HA的结构有了更深入和更细致的理解，这也为疫苗学家提供了采用结构导向设计疫苗的机会。
HA是一种I型膜糖蛋白，它形成的同源三聚体有5到7个糖基化位点（图2a，左图），是中和抗体的主要靶点。HA通过与受体、宿主呼吸上皮细胞糖蛋白或糖脂上的末端唾液酸结合介导病毒进入，并介导病毒包膜与宿主细胞融合。不同亚型HA的分子结构已经被测定。尽管流感病毒亚型和类型之间的表面序列组成和糖基化模式不同，特别是在球状头部的受体结合位点（RBS）附近，不同菌株HA的整体结构是保守的。RBS本身是一个浅口袋，由三个次级元素包围，130环、190螺旋和220环，碱基由四个高度保守的氨基酸残基组成。在H1和H3病毒中，HA头部N-l连接的糖基化位点数量在进入人群后增加，这些修饰可能导致病毒的“抗原漂移”。一个例子是大流行性H1N1毒株进化为季节性毒株，在此过程中，它在RBS附近获得了两个额外的聚糖，有效地掩盖了各自的抗原区，使其无法被抗体识别。HA的体液反应与保护性免疫有关。病毒感染和季节性接种疫苗，可常规诱发针对HA头部区域的抗体。这些抗体通过阻断病毒进入宿主细胞或阻止受体介导的内吞作用提供免疫。记忆B细胞和长寿命浆细胞通常在感染或免疫后被发现，以提供持久的保护，以抵御匹配或密切相关的病毒。然而，这些抗体往往是株特异性的，不能中和漂移的变异，主要是由于HA球状头部的高突变率，特别是在RBS周围区域。
早在20世纪90年代，人们就发现了针对HA茎区的广泛中和抗体。从小鼠体内分离的C179单克隆抗体具有异常广泛的特异性，可中和许多1类HA病毒，包括H1、H2、H5、H6和H9亚型。与大多数识别高度可变HA头部区域的HA抗体不同，C179与HA的茎区结合。一项后续研究也表明，用缺乏头部结构域的免疫原进行免疫接种可以诱导异亚型保护性免疫，这表明只有HA茎的免疫原可以诱导更广泛的抗体。随后，这类抗体从人类身上分离出来，并对几种抗体的结构进行了广泛的鉴定。广泛中和抗体，如CR6261和F10，与大多数第1组流感A HA亚型病毒发生交叉反应。
大多数针对茎的抗体能中和第1组或第2组中的流感病毒株。尽管这些针对茎的抗体存在于人类体内，但大多数抗体在人类血清中的普遍性较低，中和效力也不如直接作用于HA头部区域的抗体。最近，两个小组分别设计和构建了“无头”HA结构。在一种设计中，HA茎被三聚结构域稳定，而在另一种设计中，茎被融合并呈现在细菌铁蛋白纳米颗粒上。两种无头免疫原都能诱导异基因亚型免疫，保护动物免受外来致命H5N1病毒的攻击。其中一个目前正在进行1期临床试验。总的来说，以茎为基础的免疫原是具有广泛保护性的疫苗的有前途的候选物，值得进一步临床研究。
除了保守的茎表位外，针对HA头部的广泛中和抗体，特别是RBS也有新的进展。2009年首次报道了一种结合抗原位点B的抗体C139/1，它能中和许多流感亚型（H1、H2、H3、H5、H9和H13）。许多具有不同程度特异性的头部抗体随后被鉴定出来，并且这些抗体大多数倾向于亚型特异性10、11、13、14、16～18、20、96、97。它们通过阻断病毒与宿主细胞的粘附来中和病毒。针对位于RBS外的HA头部的其他位点的抗体最近被鉴定出来，这些抗体不介导HAI，但可以介导中和。
基于其他病毒蛋白的疫苗
除了利用和改善对HA抗原的体液免疫反应外，通用流感病毒疫苗还可能受益于其他抗原。
神经氨酸酶（NA）。最近一项利用人类流感模型的研究表明，血清神经氨酸酶抑制活性可能比目前的HAI滴度（金标准）更能预测对活病毒攻击的易感性。NA是一种Ⅱ型跨膜糖蛋白，由11个亚型分为三个遗传群（图3a）。这种四聚体蛋白的主要功能是促进新生病毒从宿主细胞上释放，在流感病毒的复制和传播中具有重要作用（图3b）。虽然抗NA的抗体已经被鉴定出来，但对它们如何影响流感病毒感染的结果却知之甚少。NA小分子抑制剂，如达菲(oseltamivir)、瑞乐沙(zanamivir)和拉尼那米韦(laninamivir)等，可以调节疾病的严重程度。NA的抗原漂移和移位被认为是独立于HA发生的。创造“共识”的核酸免疫原，正在动物模型中进行试验，有望将核酸作为一种更普遍的疫苗的组成部分。
基质蛋白2胞外域。甲型流感病毒基质蛋白2胞外域（matrix protein 2 ectodomain，M2e）被认为是一种通用的疫苗抗原，但M2e面临着多重挑战。虽然M2离子通道对于流感病毒出芽是必不可少的，并且，它是高度保守的，但其表面暴露的氨基末端外结构域免疫原性较差。如果M2e与各种载体结合或以病毒样颗粒形式传递，其免疫原性就会提高。
基于M2e的免疫定量化具有挑战性，并限制了疫苗有效性的大规模试验。佐剂可以改善M2e的免疫反应，在一项1期临床试验中， M2e-鞭毛融合蛋白疫苗在高剂量时可诱导强烈的抗体反应。鉴于M2e是一种相对较小的蛋白质，并且病毒逃逸突变体已经被鉴定出来，因此基于M2e的疫苗更有可能作为HA-b疫苗的辅助来提供额外的保护性免疫，特别是当疫苗和流行株之间存在不匹配时。
核蛋白（nucleoprotein，NP）。NP是一种存在于甲型流感病毒株之间的内部蛋白，已被确定为T细胞免疫的靶点，并在早期临床试验中进行了研究。当与季节性疫苗一起使用时，这种疫苗还能增强T细胞和菌株特异性抗体反应。在流感试验中，MVA-NP+M1疫苗接种者的症状评分低于未接种疫苗的对照组，尽管研究的人数很少。在动物模型和人类流感病毒中比传统的灭活流感疫苗诱导了更好的T细胞反应。
疫苗佐剂
另一种改进流感疫苗的方法是在疫苗配方中加入佐剂。佐剂是一种免疫刺激剂，它能增强抗原的免疫原性。它们还可能提供其他优势，如节省剂量、更理想的免疫反应、加速疫苗诱导反应以及提高免疫应答不良人群（如老年人和免疫抑制患者）的免疫原性。几种佐剂已被批准用于流感疫苗，包括明矾、MF59、AS03和AF03。最广泛使用的疫苗佐剂铝盐，与H1N1或H5N1大流行性流感疫苗一起使用时效果甚微。MF59是一种角鲨烯水包油乳剂，自1997年以来被批准用于流感疫苗，它可以提高季节性和大流行性亚单位疫苗的抗体反应，并被证明能增强预防流感住院治疗的效果。与MF59类似，AS03和AF03都是含有角鲨烯的油-水佐剂，具有相似的作用模式。AS03和AF03都已被批准用于大流行性流感疫苗。
总的来说，这些佐剂是安全的并具有良好的耐受性，且提高了体液免疫反应的效力和广度。其他佐剂已在动物模型和临床试验中进行了试验，包括皂甙、TLR激动剂、多糖和糖脂。皂甙是常见于植物中的两亲性糖苷，新一代基于皂甙的佐剂Matrix-M已进入第二阶段试验，并在H7N9疫苗中显示出疗效。
TLR激动剂通过促进先天性炎症反应和诱导适应性免疫来提高疫苗效力和抗肿瘤免疫。TLR激动剂曾在动物研究中与各种流感免疫原一起使用，并在临床试验中显示出不同程度的疗效提高。
为了在下一代流感疫苗中使用佐剂，需要仔细考虑佐剂对人体的有效性，以及生产的方便性。更重要的是，需要评估新型佐剂的安全性和疫苗的风险效益。
结语
通用流感疫苗的临床开发面临着其他病原体计划所不常见的挑战。比如打破现有的研发、生产、配置和制造等监管流程。目前的疫苗已经使用了70多年，被认为不足以应对季节性流感病毒株的抗原变异或大流行病毒株的威胁。疫苗每年都要重新配制和制造，这个过程涉及数百万个胚胎卵、基因重组、疫苗病毒的扩增和全球范围内的分发。许多组织投入大量资源用于疫苗效力、安全性和临床使用的监测、评估和建议。尽管这个繁琐而复杂的系统已经根深蒂固，但它只为世界70亿居民生产几亿支疫苗，在疫苗所针对的病毒与流通毒株完全匹配的年份，疫苗效力至多为60%。然而，该系统需要改进，需要开发新的疫苗、改进疫苗技术。
最近许多流感疫苗已获得加速批准，然而，加速审批会伴随着大量上市后的突发事件。建立上市后的风险识别和分析系统也是至关重要的。
目前季节性流感疫苗的生产体系在过去40年中相对没有什么变化。结构生物学、流感病毒学和免疫领域的进展为改进季节性和通用型流感疫苗奠定了基础。流感疫苗领域接受这些新技术并迈出了开发下一代疫苗的第一步。流感疫苗领域的持久进展现在是可以实现的，但这些进展取决于从资助机构到基础科学家、流行病学家、监管者、制造商和公众等多个学科的利益相关者的专业知识、交流与合作。
（编译：刘亚青）
参考文献：Nature Reviews | Drug Discovery 2020;19:239-252