通过全基因组测序、直接PCR和培养等手段在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定，证实了该病毒的存在。该冠状病毒引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染的肺炎”（novel coronavirus-infected pneumonia, NCIP）（现更名为COVID-19）。

2019年12月，中国武汉出现一群不明原因的肺炎患者，经查证，发现这些患者的发病原因与一个海鲜批发市场有关。研究者通过对这些肺炎患者的样本进行无偏序测序，发现一种以前未知次冠状病毒（β-回旋病毒）。将从人类气道上皮细胞分离的一种新型冠状病毒命名为“2019-nCoV”（现称SARS-CoV-2），该病毒在sarbecovirus亚属，Orthocoronavirinae亚科内形成了另一个进化枝。与MERS-CoV和SARS-CoV不同，2019-nCoV是感染人类冠状病毒家族中的第七个成员。

新出现和重新出现的病原体是对公共卫生的全球性挑战。冠状病毒是一种包膜RNA病毒，广泛分布于人类、其他哺乳动物和鸟类中，可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统疾病。已经有六种冠状病毒会导致人类发病。其中4种病毒：229E、OC43、NL63和HKU1很普遍，通常在具有免疫能力的个体中引起普通感冒症状。另外两种病毒：严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）是人畜共患传染病，有时与致命疾病有关。SARS-CoV是2002年和2003年广东省暴发严重急性呼吸道综合征疫情的病原体。MERS-CoV是2012年中东爆发严重呼吸系统疾病的病原体。鉴于冠状病毒的高度流行和广泛分布，其基因组的巨大遗传多样性和频繁重组，以及人-动物活动的增加，由于频繁的跨物种感染和偶然的外溢事件，新型冠状病毒可能会在人类中周期性地出现。

2019年12月下旬，多家当地卫生机构均报告一群不明原因肺炎患者，流行病学调查表明，与中国湖北省武汉市的一家海鲜批发市场有关。2019年12月31日，中国疾病预防控制中心（CDC）派出了一个快速反应小组，协同湖北省和武汉市卫生部门开展流行病学和病因学调查。CDC专家组报告了调查的结果，确定了肺炎的来源，并描述了在肺炎患者中检测到的一种新型冠状病毒，其样本在疫情早期由CDC专家小组检测。CDC小组还对其中两例肺炎的临床特征进行了描述。

1、研究方法

病毒诊断

从武汉市于2019年12月21日或以后确诊的不明原因肺炎患者中采集了包括支气管肺泡灌洗液在内的4份下呼吸道样本，这些患者在发病前曾去过华南海鲜市场。从北京医院因已知原因引起的肺炎患者中收集7份支气管肺泡灌洗液样本作为对照。用高纯度病毒核酸试剂盒，从临床样本（包括作为阴性对照的未受感染的培养物）中提取核酸。使用荧光定量PCR系统，用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR) 检测核酸样本中的病毒和细菌。对22种病原菌样本(18种病毒，4种细菌)进行分析。此外，无偏倚、高通量测序用于鉴别无法通过上述方法识别的微生物序列。实时反转录·聚合酶链反应(reverse transcription PCR，RT-PCR)通过靶向泛β-CoV的共有RdRp区来检测病毒RNA。

病毒分离

收集支气管肺泡灌洗液样本，置于无菌杯中；然后，将样品离心，去除细胞碎片。将上清液接种在人类气道上皮细胞上，该细胞是从接受肺癌手术的患者切除的气道标本中获得的，确认不含特殊病原体。将人类气道上皮细胞在塑料基质上扩增以产生传代-1代细胞，然后以每孔2.5×105个细胞的密度接种在可渗透的Transwell-COL（直径12毫米）支持物上。将人类气道上皮细胞在气液界面培养4周～6周，形成分化良好的极化培养物，类似于体内假层状黏液上皮。每天用光镜观察细胞病变，用RT-PCR检测上清液中是否存在病毒核酸。三次传代后，制备根尖标本和人类气道上皮细胞进行透射电镜观察。

透射电子显微镜观察

收集具有细胞病变的人类气道上皮细胞，制作切片，使用透射电镜下观察阴性染色网格和超薄切片。

病毒基因组测序

以支气管肺泡灌洗液和培养上清液中提取的RNA为模板进行基因组克隆和测序。设计特异性引物进行PCR，并使用5'- 或者3'-RACE技术 (rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增)填补常规Sanger测序的基因组空白。对全基因组进行了系统发育分析。

2、研究结果

三名患有严重肺炎的成年患者于2019年12月27日入住武汉某医院。患者1为49岁女性，患者2为61岁男性，患者3为32岁男性。1号和2号患者的临床资料可用。

患者1无慢性病史，但于2019年12月23日出现发热(体温37℃至38℃)和咳嗽，胸部不适。发病4天后，咳嗽和胸部不适加重，但发热减轻；肺炎的诊断依据是计算机断层扫描(computed tomographic，CT)；她是海鲜批发市场的零售商。

患者2于2019年12月20日出现发热和咳嗽症状; 发病后7天出现呼吸窘迫，并在接下来的2天内恶化（参见胸部X线片，图1），这时开始了机械通气。他是海鲜批发市场的常客。

患者1、3于2020年1月16日康复出院。患者2于2020年1月9日死亡。

新型冠状病毒的检测和分离

2019年12月30日，从武汉市金银潭医院采集三份支气管肺泡灌洗液样本。在这些患者的临床标本中未检测到特定病原体（包括HCoV-229E、HCoV-NL63、HCoV-OC43和HCoV-HKU1）。从患者的支气管肺泡灌洗液中提取的RNA用作模板，结合Illumina测序和纳米孔测序对基因组进行克隆和测序。从单个样本中获得20000多个病毒片段，并且大多数叠连群与蝙蝠SARS样冠状病毒（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）基因组匹配。使用人类气道上皮细胞以及Vero E6和Huh-7细胞株分离病毒。分离出的病毒被命名为2019-nCoV（现已更名为SARS-CoV-2）。

为了确定能否在2019-nCoV感染的人类气道上皮细胞中观察到病毒颗粒，在接种后6天，分别用光学显微镜和透射电镜观察模拟感染和2019-nCoV感染的人类气道上皮细胞培养物。在人类气道上皮细胞表面接种96小时后观察细胞病理效应;用光学显微镜在焦点中心观察到纤毛搏动不足(图2)。直到接种后6天，在Vero E6和Huh-7细胞系中都没有观察到特异性的细胞病变。

阴性染色的2019-nCoV粒子的电子显微照片通常为球形，具有多态性(图3)。直径从60到140纳米不等。病毒粒子有非常独特的尖刺，大约9到12纳米，使病毒粒子看起来像日冕。在人气道上皮超薄部分发现了细胞外游离病毒颗粒和填充在细胞质膜囊中的病毒颗粒的包涵体。观察到的形态与冠状病毒科一致。

为进一步鉴定该病毒，通过Illumina和纳米孔测序，从支气管肺泡灌洗液和人类气道上皮细胞病毒分离株获得2019-nCoV基因组的从头序列。新的冠状病毒是从三个病人身上鉴定出来的。从支气管肺泡灌洗液中获得两个近全长的冠状病毒序列，并从患者分离的病毒中获得一个全长序列。

尽管2019-nCoV与蝙蝠体内检测到的一些β-回旋病毒相似，但它与SARS-CoV和MERS-CoV不同。来自武汉的3株2019-nCoV冠状病毒与两株蝙蝠源SARS样株ZC45和ZXC21构成了sarbecovirus亚属B系的一个独特分支。来自人类的SARS-CoV株与来自中国西南部蝙蝠的SARS样冠状病毒在sarbecovirus亚属内形成了另一个分支。由于2019年nCoV与betacoronavirus的其他成员在保守复制酶结构域（ORF1AB）中的序列同源性小于90%，2019-nCoV是一种新型的冠状病毒。

3、研究讨论

CDC专家小组报告了一种新型冠状病毒（2019-nCoV），于2019年12月和2020年1月在中国武汉的住院患者中发现。通过全基因组测序、直接PCR和培养等手段在三名患者的支气管肺泡灌洗液中进行鉴定，证实了该病毒的存在。该冠状病毒引起的疾病被称为“新型冠状病毒感染的肺炎”（novel coronavirus-infected pneumonia, NCIP）。完整的基因组被提交给全球最大的流感及新型冠状病毒数据平台GISAID。系统发育分析显示，2019-nCoV属于betacornavirus属，该属包括在人类、蝙蝠和其他野生动物中发现的冠状病毒（SARS-CoV、蝙蝠类SARS-CoV等）。CDC小组报道了病毒的分离及其特异性细胞病变效应和形态学的初步描述。

CDC专家的分析提供了2019-ncov在武汉暴发的证据。重要的是进行流行病学调查，以确定导致感染的传播模式、繁殖间隔和临床谱，以完善可预防、控制和阻止2019-nCoV传播的策略。（报道：贾盛崧）

参考文献：New England Journal of Medicine 2020 DOI:10.1056/NEJMoa 2001017